反相色譜條件下三唑類手性農(nóng)藥對(duì)映異構(gòu)體的拆分

　　采用自制的纖維素三手性固定相和直鏈淀粉三手性固定相，在反相色譜條件下成功地拆分了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇對(duì)映異構(gòu)體。

　　兩種固定相都有很強(qiáng)的拆分能力。在優(yōu)化的色譜條件下，己唑醇和烯唑醇在這兩種固定相上都能被分離；三唑酮只能在CDMPCCSP上分離；粉唑醇、戊唑醇、烯效唑只能在ADMPCCSP上分離。流動(dòng)相中水的含量增加會(huì)使對(duì)映體的保留增強(qiáng)，分離的可能性增大。在0～40℃研究溫度范圍內(nèi)，容量因子k隨溫度的升高而減少，除烯效唑與戊唑醇外，其它手性農(nóng)藥的選擇因子α也隨溫度的升高而減少，而分離度Rs隨溫度變化沒有明顯的規(guī)律，最好的分離度不都出現(xiàn)在低溫。對(duì)映體流出順序用圓二色檢測(cè)器測(cè)定。

　　1引言

　　近年來，隨著手性技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)光學(xué)活性農(nóng)藥的研究已成為農(nóng)藥化學(xué)領(lǐng)域的熱門課題。在已商品化的農(nóng)藥中，約有26%的農(nóng)藥具有手性中心，其中大部分都是以外消旋體的形式出售和使用。將外消旋的手性農(nóng)藥施加于生物體時(shí)，對(duì)映體之間的差異不僅表現(xiàn)在生物活性上，還表現(xiàn)在對(duì)生物體的毒性、體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)移、代謝以及消除等方面。因此建立高分離度、高靈敏度的手性農(nóng)藥拆分和測(cè)定方法具有重要的意義。常用的手性分離方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、分子烙印和毛細(xì)管電泳法等，其中高效液相色譜手性固定相法是重要的一種。在眾多的手性固定相中，多糖（常用纖維素和淀粉）衍生物CSPs顯示出拆分能力強(qiáng)、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇等均屬于三唑類農(nóng)藥，是一類重要的廣譜殺菌劑。有關(guān)其對(duì)映體的拆分方法主要有氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、手性流動(dòng)相添加劑法、手性固定相法和多糖類手性固定相法等。而多糖類手性固定相高效液相色譜法主要在正相條件下對(duì)三唑類農(nóng)藥進(jìn)行拆分。本研究利用自制的纖維素三（3，5二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（CDMPCCSP）和直鏈淀粉三（3，5二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（ADMPCCSP），在反相色譜條件下，以甲醇/水或乙腈/水為流動(dòng)相，在高效液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)了己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、三唑酮和戊唑醇對(duì)映體的拆分。比較了固定相、流動(dòng)相、溫度對(duì)手性拆分的影響，同時(shí)利用圓二色檢測(cè)器測(cè)定了對(duì)映體的流出順序。

　　2實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1儀器與試劑1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），配二極管陣列檢測(cè)器；JASCO2000高效液相色譜儀（日本JASCO公司），配圓二色檢測(cè)器；液相色譜裝柱機(jī)（北京福思源機(jī)械加工部）；AT930制冷、加熱兩用色譜柱溫箱（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。3，5二甲基苯基異氰酸酯（Merck公司）；直鏈淀粉球（Sigma公司）；微粒硅膠（中國(guó)科學(xué)院蘭州化物所）：球形，粒度5～7μm，比表面積110m2/g，平均孔徑6.7nm；微晶纖維素（上海試劑四廠）；3氨基丙基三乙氧基硅烷（KH550，遼寧蓋縣化工廠）。所用試劑均為分析純，流動(dòng)相重蒸后使用。6種三唑類手性農(nóng)藥由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥殘留分析組提供。

　　2.2手性固定相的合成參照文獻(xiàn)的方法合成手性固定相CDMPC和ADMPC，于37MPa壓力下裝入不銹鋼柱。

　　2.3色譜條件色譜柱：CDMPCCSP（250mm×4.6mm），ADMPCCSP（150mm×4.6mm）；流動(dòng)相為甲醇水或乙腈水；流速為0.8mL/min（CDMPC）和0.5mL/min（ADMPC）；進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。容量因子（k）、選擇因子（α）和分離度（Rs）分別按公式k=（t-t0）/t0，α=k2/k1，Rs=2（t2-t1）/（w1 w2）計(jì)算。

　　3結(jié)果與討論

　　3.1不同固定相及流動(dòng)相組成對(duì)對(duì)映體拆分的影響在CDMPCCSP和ADMPCCSP上以甲醇水或乙腈水為流動(dòng)相對(duì)三唑類農(nóng)藥己唑醇、烯唑醇、烯效唑、粉唑醇、戊唑醇和三唑酮對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了直接的手性拆分。在優(yōu)化的色譜條件下，己唑醇、烯唑醇和三唑酮在CDMPC上分離度分別達(dá)1.72，1.31和1.55；己唑醇、烯唑醇、粉唑醇、烯效唑和戊唑醇在ADMPC上分離度分別達(dá)到1.28，2.75，1.05，2.41和1.30。在同一種固定相、不同的流動(dòng)相對(duì)樣品的保留、立體選擇性也不同。如在ADMPCCSP上，烯唑醇和粉唑醇只能在甲醇水作流動(dòng)相下拆開，已唑醇則只能在乙腈水作流動(dòng)相下拆開。甲醇既是質(zhì)子的受體也是供體；乙腈只是質(zhì)子的受體。這說明氫鍵不一定是反相條件下拆分的主要作用力。隨著流動(dòng)相中水含量的增加，分離的可能性增大，但考慮到柱子的壽命和柱效，本實(shí)驗(yàn)中水分含量對(duì)于甲醇和乙腈分別達(dá)40%和60%。本研究組曾報(bào)道在正相色譜條件下，戊唑醇和三唑酮可以在CDMPC上拆分。氫鍵、ππ、偶極偶極作用通常被認(rèn)為是多糖類固定相在三唑類手性農(nóng)藥在ADMPCCSP上反相條件下的拆分色譜圖。

　　Fig.2Chromatogramsshowingtheenantiomericseparationoftriazolechiralpesticidesa.己唑醇（Hexaconazole），乙腈/水（ACN/water）45∶55，V/V；b.烯唑醇（Diniconazole），甲醇/水（Methanol/water），80∶20，V/V；c.粉唑醇（Flutriafol），甲醇/水（Methanol/water）70∶30，V/V；d.烯效唑（Uniconazole），乙腈/水（ACN/water）60∶40，V/V；e.戊唑醇（Tebuconazole），乙腈/水（ACN/water），50∶50，V/V；室溫（Roomtemperature）；流速（Flowrate）0.5mL/min。正相色譜條件下拆分的有效作用力；而在反相條件下，強(qiáng)極性流動(dòng)相更容易與CSP形成強(qiáng)的氫鍵作用，從而減弱了溶質(zhì)分子與CSP的氫鍵作用，這將可能使分析物在固定相的螺旋型手性空穴中的包容作用和“立體適應(yīng)性”（Stericfit）、疏水作用、ππ、偶極偶極相互作用成為手性識(shí)別的關(guān)鍵因素。

　　3.2溫度對(duì)對(duì)映體拆分的影響在0～40℃范圍內(nèi)，考察了溫度對(duì)三唑類手性農(nóng)藥對(duì)映體拆分的影響。結(jié)果表明，所研究的手性農(nóng)藥對(duì)映體的容量因子k隨著溫度的升高而減??；選擇因子α沒有一致的規(guī)律；不同農(nóng)藥的最佳分離度出現(xiàn)在不同的溫度，而不是都出現(xiàn)在低溫。

　　通過測(cè)定不同溫度下的容量因子k和手性選擇因子α，以lnk和lnα分別對(duì)1/T作圖，各自可以得到一條直線。通過考察溫度對(duì)手性分離的影響，可以計(jì)算出手性分離過程中的熱力學(xué)參數(shù)，從而對(duì)手性分離過程有更加深入的了解。除了烯效唑的選擇因子的自然對(duì)數(shù)與絕對(duì)溫度的倒數(shù)在甲醇作改性劑時(shí)在ADMPC上不呈線性關(guān)系（圖3），其它手性農(nóng)藥的van′tHoff曲線都具有線性，計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)見表1。戊唑醇在甲醇作改性劑時(shí)，在ADMPC上的手性拆分主要受熵控制，而在乙腈作改性劑時(shí)主要受焓控制；其它農(nóng)藥（除烯效唑）手性拆分主要受焓控制。表10～40℃范圍內(nèi)，手性農(nóng)藥對(duì)映體的Van′tHoff方程和ΔΔH°、ΔΔS°。

　　3.3對(duì)映體的流出順序近年來，高效液相色譜圓二色檢測(cè)器已成為手性化合物分析的有力工具。本研究利用高效液相色譜圓二色檢測(cè)器測(cè)定了對(duì)映體流出順序（見表2），3種三唑類手性農(nóng)藥在CDMPCCSP上，2種流動(dòng)相條件下，同一波長(zhǎng)下的流出順序一致；而在ADMPCCSP上，烯效唑與烯唑醇的出峰順序相反，其它手性農(nóng)藥出峰順序一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，一般認(rèn)為是流動(dòng)相成分的改變導(dǎo)致了手性空腔的立體環(huán)境發(fā)生變化所致。表2三唑類手性農(nóng)藥在CDMPCCSP和ADMPCCSP上反相條件下對(duì)映體流出順序。