傳感器法檢測(cè)甲萘威殘留的研究
1 引言
本文引用地址:http://m.butianyuan.cn/article/79141.htm近年來食品安全越來越引起世界各國的重視,對(duì)食品中農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)一直是食品衛(wèi)生科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn),而且具有重要的臨床診斷價(jià)值。有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的常用檢測(cè)手段是色譜法、色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法和波譜法。這些方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確,但都具有儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴、操作繁瑣等問題,而且常常需要液-液萃取或固-液萃取等繁瑣的前期處理過程,不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需要。隨著近代電子技術(shù)和生物工程的快速發(fā)展,生物傳感器越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。生物傳感器由于其具有生物反應(yīng)的快速、高特異性、高靈敏度的特點(diǎn),為農(nóng)藥殘留速測(cè)問題的解決提供了一種新的方法。
膽堿酯酶電流型生物傳感器工作原理:底物氯化乙酰硫代膽堿在膽堿酯酶的催化作用下可以水解為乙酸和巰基膽堿,巰基膽堿具有電活性,在外加一定電勢(shì)的前提下,可在Pt、玻碳等基礎(chǔ)電極表面氧化,所產(chǎn)生的氧化電流強(qiáng)度可反映出它在電極表面的濃度。當(dāng)膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制時(shí),該氧化電流的大小能準(zhǔn)確地反應(yīng)酶被抑制的程度,從而檢測(cè)出農(nóng)藥殘留的濃度。
2 主要試劑與儀器
乙酰膽堿酯酶(AChE,來自電鰻,Sigma),氯化乙酰硫代膽堿(ATChCl,Sigma),牛血清白蛋白(BSA,上海伯奧生物科技有限公司),戊二醛(25%水溶液,上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司),尼龍微孔濾膜、硝酸纖維素微孔濾膜、醋酸纖維素微孔濾膜(孔徑均為0.45μm,上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠),其他試劑均為分析純,溶液均用去離子水配制。CHI800電化學(xué)分析儀(工作電極為玻碳電極,參比電極為飽和甘汞電極,對(duì)電極為鉑電極,上海辰華儀器公司)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
3.1 酶促反應(yīng)的電化學(xué)檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)中的工作電極是玻碳電極,將玻碳電極用0.3 μm的Al2O3懸濁液在麂皮上拋光至形成鏡面,用去離子水清洗后,在0.50 mol?L-1H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法活化,掃描范圍0~1.0 V,反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。用準(zhǔn)備好的玻碳電極來檢測(cè)酶促反應(yīng)的特點(diǎn)。
以pH7.40、濃度0.10 mol?L-1的Na2 HPO4-KH2PO4磷酸緩沖溶液為支持電解質(zhì),加入10.0μL酶液催化反應(yīng)90 s后,以100 mV?s-1的掃速在0~1.0 V區(qū)間進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。然后加入0.50 mL,0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代膽堿(ATChCl)相同條件下進(jìn)行掃描。
如圖1所示,在沒有加酶的底物溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描時(shí)沒有出現(xiàn)峰(曲線a),當(dāng)加入10.0μL酶液,酶催化反應(yīng)產(chǎn)物硫代膽堿在電位大約為0.70 V處出現(xiàn)明顯的氧化峰(曲線b)。而陰極化掃描無峰,表明電極反應(yīng)不可逆。由此可見,硫代膽堿在玻碳電極表面的氧化是一個(gè)不可逆過程。利用硫代膽堿的這種性質(zhì)可以研制生物傳感器,實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥的檢測(cè)。
3.2 游離酶活力與峰電流的關(guān)系
在9.50 mL pH為7.40的磷酸緩沖溶液中,分別加入2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μL濃度為0.10 u/μL的酶溶液,然后各加入0.50 mL 0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代膽堿(ATChCl),在20℃下催化反應(yīng)90 s后,在三電極系統(tǒng)中進(jìn)行線性伏安掃描,分別記錄氧化峰電流。由圖2可知,氧化峰電流的大小與酶活力大小顯著相關(guān),線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9964。
3.3 膽堿酯酶的固定化
選擇AChE的固定化條件的實(shí)驗(yàn)中,分別取一定量的濃度0.10 U/μL的AChE溶液、不同濃度的BSA和戊二醛溶液于0.5 mL的離心管中,在旋渦混合器上混勻后,將10片直徑為6 mm的微孔濾膜片浸入混合酶溶液中,在4℃下進(jìn)行固定化。8 h后將酶片取出,用pH 8.00的磷酸緩沖液反復(fù)清洗,常溫下干燥。測(cè)定酶活力時(shí),將直徑為6 mm固定化酶片利用橡膠管固定在玻碳電極的表面,使酶片緊貼電極表面,形成酶電極作為工作電極,與Ag/AgCl參比電極和鉑對(duì)電極構(gòu)成三電極檢測(cè)系統(tǒng)。
首先,對(duì)固定化載體進(jìn)行篩選。載體的物理和化學(xué)性質(zhì)直接影響固定化酶片的活力。本試驗(yàn)從孔徑均為0.45μm硝酸纖維素微孔濾膜、尼龍微孔濾膜、醋酸纖維素微孔濾膜三種最通用的商品載體膜中篩選出最適宜的載體。依次取10.0 U膽堿酯酶(AChE)、30.0μL 1.0%的BSA、10.0μL 5.0%的戊二醛溶液于0.50 mL的離心管中,旋渦混合器上混勻。分別固定在硝酸纖維素濾膜片、醋酸纖維素濾膜片、尼龍濾膜片上,4℃下固定8 h。固定好后將酶片取出沖洗、常溫下干燥后,測(cè)定酶活力以選擇酶的固定載體。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),如圖3所示,尼龍微孔濾膜和醋酸纖維素微孔濾膜作為固定化載體所固定的酶片活力低,且在操作過程中容易破損,因而不予選用。而以硝酸纖維素微孔濾膜作為固定化載體所制成的固定化酶片酶活力高、重現(xiàn)性好、機(jī)械強(qiáng)度高,從而作為本實(shí)驗(yàn)的固定化載體。
其次,對(duì)固定化酶液濃度進(jìn)行選擇。分別取25.0,50.0,75.0,100.0,125.0,150.0μL的0.10U/μL AChE溶液、30.0μL1.0%的BSA、10.0μI。5.0%的戊二醛于0.5 mL的離心管中,加入磷酸緩沖液至刻度,旋渦混合器上混勻。將10片直徑為6mm的硝酸纖維素微孔濾膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8 h。固定好后將酶片取出、常溫下干燥后,確定固定化酶液的濃度。由圖4可見,當(dāng)固定化酶液濃度在20 U/mL以下時(shí),隨著酶量的增大,酶片活力也隨之增加,而在20 U/mL以上時(shí),酶量繼續(xù)增加,酶片活力卻增加的很少。因此,選擇固定化酶液濃度為20 U/mL。
另外,對(duì)戊二醛濃度進(jìn)行篩選。戊二醛能在溫和的條件下與蛋白質(zhì)的自由氨基反應(yīng),交聯(lián)膜的厚度及戊二醛的含量對(duì)傳感器的響應(yīng)具有重要的影響。戊二醛的濃度較低時(shí),蛋白質(zhì)溶液不會(huì)被固定化,而戊二醛的濃度較高又會(huì)使酶失活。
確定AChE的量為100μL后,取30μL 1.0%。的BSA、10 μL濃度分別為1.0%,2.5%,5.0%,10.0%,15.0%,25.0%的戊二醛于0.5 mL的離心管中,旋渦混合器上混勻。將直徑為6 mm的硝酸纖維素微孔濾膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8h。固定好后將酶片取出沖洗,常溫下干燥后,測(cè)定酶活。由圖5可知,當(dāng)戊二醛濃度為1.0%和2.5%時(shí),不足以將膽堿酯酶固定在載體上而使固定化酶片活力低,而當(dāng)戊二醛濃度高于5.0%時(shí),由于戊二醛是強(qiáng)變性劑能使酶失活,從而使固定化酶片活力損失嚴(yán)重,因此本實(shí)驗(yàn)確定戊二醛濃度為5.0%。
最后,考察牛血清白蛋白(BSA)濃度的影響。當(dāng)酶的濃度較低時(shí),加入戊二醛難以發(fā)生分子間交聯(lián),只形成水溶性低聚物,達(dá)不到固定酶的作用,因此需要加入大量惰性蛋白質(zhì)。最常用的惰性蛋白質(zhì)是BSA,BSA含有豐富的賴氨酸殘基,易與戊二醛作用產(chǎn)生非水溶性的聚合物。依次取100.0μLAChE溶液、濃度分別為0.1%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%各30.0μL的’BSA、10.0μL 5%的戊二醛溶液于0.5 mL的離心管中,旋渦混合器上混勻。將直徑為6 mm的硝酸纖維素微孔濾膜片浸入混合酶溶液中,4℃固定8 h。固定好后將酶片取出沖洗,常溫下干燥后測(cè)酶活性。從圖6可以看出,當(dāng)BSA濃度低時(shí),戊二醛分子直接與酶分子接觸,發(fā)生劇烈的交聯(lián)反應(yīng),使酶分子失活,而當(dāng)BSA濃度高時(shí)BSA分子的大量存在,由于空間位阻的關(guān)系,酶分子不易與底物接觸到,導(dǎo)致固定化酶量減小。因此,BSA濃度選擇為1.0%。
通過上述實(shí)驗(yàn)得到最佳固定化酶的條件是:固定化載體為孔徑0.45μm硝酸纖維素膜、保護(hù)劑牛血清白蛋白(BSA)濃度為1.0%、交聯(lián)劑戊二醛濃度為5.0%,固定化用酶液濃度為20 U/mL。在最佳固定化條件下進(jìn)行酶片的制備試驗(yàn),放入10片活化過的硝酸纖維素濾膜片,4℃固定8 h。同一批次制備的酶片活力數(shù)據(jù)見表1。
由表1可知,同一批次固定的酶片活力相近,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.61%~14.01%;不同批次固定的酶片活力差別不大,平均活力為1.97~2.09μA。對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),結(jié)果表明,數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異。說明該固定化方法制備的酶片活力重現(xiàn)性好,方法穩(wěn)定可靠。
為了考察固定化酶片的貯存穩(wěn)定性,將固定化酶片室溫下干燥后,4℃保存。每2天測(cè)定酶活力,以時(shí)間與活力值作圖。如圖7,固定化酶片在一周內(nèi)活性損失小于5%,在15天后,仍能保持其80%的活力。說明該方法得到的酶片具有較好的貯存穩(wěn)定性。
3.4 生物傳感器法對(duì)甲萘威的檢測(cè)
首先繪制甲萘威濃度與酶抑制率的關(guān)系曲線。將酶片固定在玻碳電極上后,在10.0 mL電解池中加入9.00mL磷酸緩沖液,加入0.50 mL 0.01mol?L-1底物ATChCl,20℃催化反應(yīng)90 s,進(jìn)行線性伏安掃描,記錄氧化峰電流,此為初始電流值I0。然后相同條件下各加入0.50 mL濃度分別為1000.0,500.0,100.0,50.0,10.0,5.0,1.00,0.10,0.01,0.001 mg?L-1的甲萘威溶液,抑制反應(yīng)10 min后,加入0.50 mL,0.01 mol?L-1氯化乙酰硫代膽堿,20℃催化反應(yīng)90 s,線性伏安掃描,記錄氧化峰電流,此為抑制電流值I。由抑制率計(jì)算公式K=(I0-I)/I0計(jì)算出酶的抑制率。
以甲萘威濃度與抑制率的關(guān)系作圖,如圖8,當(dāng)甲萘威濃度在0.01~10.00 mg?L-1時(shí),甲萘威濃度的對(duì)數(shù)與抑制率呈良好的線性關(guān)系,說明該傳感器固定化酶能夠準(zhǔn)確反應(yīng)樣品中的甲荼威濃度。
取10.0 g青菜葉,適當(dāng)剪碎,置于25 mL離心管中,加入10.0 mL甲醇,振蕩3 min,將萃取液倒出,即為樣品溶液,測(cè)定其抑制率,即可得到甲萘威濃度。
3.5 生物傳感器法與GB14877-94方法結(jié)果對(duì)比
按照GB14877-94方法,當(dāng)噴灑方法一樣,噴灑量相同的蔬菜樣品用已建立的生物傳感器法與國家標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行分析測(cè)定。當(dāng)噴灑量為10 mg?L-1時(shí),GC法測(cè)定的結(jié)果是9.03 mg?L-1,生物傳感器法測(cè)定的結(jié)果是6.56 mg?L-1。
雖然與國家標(biāo)準(zhǔn)法相比,生物傳感器法的檢測(cè)結(jié)果略低,但能滿足實(shí)際檢測(cè)所需。對(duì)于生物傳感器法,整個(gè)檢測(cè)過程僅需30 min,而GC法測(cè)定則至少需要2 h。因此,生物傳感器法無疑具有廣闊的應(yīng)用前景。
4 結(jié) 語
生物傳感器是一種具有較高的靈敏度和選擇性的測(cè)試器件,由于其利用了生物分子所特有的選擇及催化性能,使其較普通的化學(xué)傳感器性能更為優(yōu)異。另一方面,應(yīng)用牛物傳感器可能實(shí)現(xiàn)簡便、快速和在線分析,以代替某些傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分析手段,從而將分析方法盡量簡化,使其能在實(shí)際常規(guī)測(cè)量中應(yīng)用,且對(duì)操作者的技能要求不高,與分析化學(xué)的總戰(zhàn)略目標(biāo)達(dá)成了一致。
本實(shí)驗(yàn)通過AChE的有效固定化,研制了一種可以用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的生物傳感器,并以氨基甲酸酯類農(nóng)藥甲萘威為例進(jìn)行了檢測(cè),雖然得到了比較理想的結(jié)果,但是利用AChE傳感器榆測(cè)農(nóng)藥殘留時(shí)反映的是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的總濃度,在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)做進(jìn)一步的檢測(cè)。
在農(nóng)藥殘留的速測(cè)方面,生物傳感器法與傳統(tǒng)的GC法相比,具有成本低、效率高、方便快捷等優(yōu)點(diǎn),適合實(shí)時(shí)檢測(cè),在追求食品安全的今天,必然有著廣泛的應(yīng)用空間。
評(píng)論