現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)生物傳感器研究

　　何保山，周愛玉，李華清，岳偉偉，羅金平，蔡新霞

　　(1.中國科學(xué)院 電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080；2.中國科學(xué)院 研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　ALT也稱作丙胺酸氨基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)各器官組織中。在肝、心、腎、胰、腦、肺、肌肉、骨骼等器官組織細(xì)胞中，都含有不同程度的ALT，但以肝臟含量為最多，存在于肝細(xì)胞漿中。ALT主要代謝功能是可以催化丙胺酸和α-酮戊二酸可逆轉(zhuǎn)換成丙酮酸和谷氨酸。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，大量的ALT就會(huì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中，升高的ALT酶活被認(rèn)為是肝細(xì)胞損傷的最特異性標(biāo)志物之一。

　　我國衛(wèi)生部規(guī)定，血清ALT檢驗(yàn)足獻(xiàn)血員健康體檢必查項(xiàng)目之一，同時(shí)規(guī)定獻(xiàn)血者的血液ALT檢測(cè)方法采用賴氏法或全自動(dòng)生化儀的速率法。但這兩種方法存在的主要問題是賴氏法耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確性差，受主觀因素影響大。而速率法雖然準(zhǔn)確，但儀器龐大，價(jià)格昂貴，需專業(yè)人士操作。面對(duì)現(xiàn)在街頭無償獻(xiàn)血者因血清ALT高造成大量不必要的獻(xiàn)血和血液浪費(fèi)問題，非常有必要建立一種快速靈敏、準(zhǔn)確方便的ALT檢測(cè)方法，這將對(duì)開展血清中ALT研究和“窗口期”肝炎預(yù)防具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

　　基于光的吸收／反射原理和酶促反應(yīng)原理，本文介紹了一種新型的谷丙轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)生物傳感器，將反應(yīng)底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，這種傳感器可以用于血清ALT的快速檢測(cè)，制作簡(jiǎn)單，成本低，適于一次性使用，在血液篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。

　　2 實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1 試劑

　　丙胺酸、α-酮戊二酸、谷丙轉(zhuǎn)胺酶(ALT，EC2.6.1.2，from porcine heart，84 U／mg)、丙酮酸氧化酶(PyOD，EC1.2.3.3，8.9 U／mg)、磷酸緩沖鹽片(PBS，0.01 mol／L，pH 7.4)購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶(POD，EC1.11.1.7，fromGrade I，horseradish，250 U／mg)購自德國Roche公司；3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、硫酸鎂、磷酸鈉購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純，溶液皆用去離子水配制，最終調(diào)節(jié)溶液pH值為7.4。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

　　血清樣本由北京醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心和北京市紅十字血液中心提供。

　　2.2 檢測(cè)原理

　　利用光的吸收／反射原理塒血清中ALT進(jìn)行快速檢測(cè)。首先血清中ALT催化丙胺酸和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸在磷酸根和丙酬酸氧化酶的作用下氧化生成乙酰磷酸和過氧化氫，生成的過氧化氫具有強(qiáng)氧化性，可以將還原性的指示劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化生成藍(lán)色化合物，致使敏感膜發(fā)生顏色變化。敏感膜顏色的深淺與過氧化氫的量直接相關(guān)，而過氧化氫又只與樣本中ALT的含量相關(guān)，因此通過光分析系統(tǒng)靈敏感知敏感膜顏色的變化即可得知樣本中ALT的含量，反應(yīng)原理為

　　2.3 ALT光學(xué)生物傳感器的制備

　　本新型光學(xué)生物傳感器由敏感膜、保護(hù)膜和基底三部分組成，分別由劃片機(jī)切割成所需尺寸，用粘合劑粘結(jié)成形(如圖1所示)。其中敏感膜用配好的反應(yīng)試劑和指示劑先后滴加其上，置于室溫風(fēng)干，最后封蓋透明保護(hù)膜即可備用。

　　2.4 傳感器系統(tǒng)組成及測(cè)量方法

　　圖2為傳感器系統(tǒng)組成的框圖。以帶有數(shù)據(jù)傳輸接口的微處理器為中樞，通過數(shù)模接口向SP62光源發(fā)送調(diào)制信號(hào)。控制光源在預(yù)定的條件下啟動(dòng)，通過模數(shù)接口自動(dòng)讀取特定波長(zhǎng)下的光信號(hào)，并即時(shí)顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。

　　測(cè)試時(shí)取血清試樣10 μL滴加在敏感膜的中央，啟動(dòng)儀器檢測(cè)，同時(shí)計(jì)時(shí)開始，待試樣擴(kuò)散均勻后，封蓋透明保護(hù)膜，將傳感器插入測(cè)試儀器，約60 s，自動(dòng)讀取光信號(hào)值，依據(jù)預(yù)先置入的反射值與ALT濃度的響應(yīng)關(guān)系，即可定量檢測(cè)血清中ALT的含量。

　　3 結(jié)果與討論

　　圖3所示的是不同濃度ALT在可見光區(qū)域內(nèi)的全波長(zhǎng)掃描圖。其中a，b，c，d，e對(duì)應(yīng)的ALT濃度分別為1000，500，250，100，25 U／L。由圖中可以看出，當(dāng)傳感器加入ALT后，波長(zhǎng)為400～700nm，生成的藍(lán)色產(chǎn)物在波長(zhǎng)660 nm處出現(xiàn)了特異性的吸收，并且隨著ALT濃度N的增加，傳感器敏感膜藍(lán)色加深，光吸收增強(qiáng)，波長(zhǎng)660 nm處反射值逐漸降低，這說明本光學(xué)生物傳感器在660 nm處分辨率最好，靈敏度也最高，這與監(jiān)色物質(zhì)對(duì)白光的吸收／反射特性是一致的。

　　實(shí)驗(yàn)表明樣本中ALT濃度N和波長(zhǎng)660 nm處反射值是線性相關(guān)的。圖4是利用ALT光學(xué)生物傳感器檢測(cè)人體血清的響應(yīng)關(guān)系圖。血清樣本由北京市紅十字血液中心提供，在20～150 U／L均勻選擇6個(gè)樣本，每個(gè)樣本測(cè)試3次，檢測(cè)時(shí)間60 s。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在20～150 U／L內(nèi)，血清ALT濃度N和反射值表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系y=0.0372x+66.055，R=0.987，線性相關(guān)系數(shù)為0.987，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清ALT的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

　　4 結(jié) 論

　　盡管對(duì)患有肝病病人的診斷中ALT具有非常重要的臨床意義，但很少有可用于肝病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷的傳感器出現(xiàn)。2003年，G．S．Xuan等人報(bào)道了一種固定有ALT抗體的電化學(xué)免疫傳感器，雖然此傳感器系統(tǒng)對(duì)ALT表現(xiàn)出優(yōu)良的檢測(cè)速度和精度，但它的形式結(jié)構(gòu)卻比較復(fù)雜，檢測(cè)上限受到抗體特性的限制。本文基于光的吸收／反射原理和酶促反應(yīng)原理提供了一種新型的ALT光學(xué)生物傳感器，反應(yīng)底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，其血清ALT檢測(cè)時(shí)間60 s，檢測(cè)范圍20～150 U／L，線性相關(guān)系數(shù)為0.987。并且這種生物傳感器制作簡(jiǎn)單，耗樣少(10 μL)，一次性使用，避免交叉感染，具有良好的臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。