非成像式流式細(xì)胞儀的發(fā)展與應(yīng)用

　　2.3? 分析和分選速度的提高

　　流式細(xì)胞儀非常重要的一個特點就是它能夠?qū)崿F(xiàn)高速的細(xì)胞定量分析和目標(biāo)細(xì)胞的分選。隨著液流控制系統(tǒng)性能的改進(jìn)和光電檢測元件響應(yīng)速度和計算機軟件系統(tǒng)的不斷發(fā)展進(jìn)步， 流式細(xì)胞儀的分析和分選速度都有質(zhì)的提高。目前，BD 公司出品的 FACSAria 流式細(xì)胞分選儀獲取速度可達(dá) 70000 個細(xì)胞 /s，分析速度可達(dá) 50000 個細(xì)胞 /s。這對于要通過對大量細(xì)胞的分析，建立不同細(xì)胞類型的數(shù)據(jù)庫具有十分重要的現(xiàn)實意義，如根據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分類等。

　　2.4? 實現(xiàn)多色分析

　　流式細(xì)胞儀另一個非常重要的特點就是它能夠?qū)崿F(xiàn)對細(xì)胞的多參數(shù)測量。通過使用多種熒光標(biāo)記物對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，測量激光激發(fā)多色熒光信號，實現(xiàn)單次實驗對細(xì)胞多種成分測量。然而，實際中熒光標(biāo)記物的發(fā)射光譜多較寬，不同的標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞后，光電檢測器檢測到的熒光信號往往有重疊的現(xiàn)象，這就需要對熒光信號進(jìn)行補償。目前 BD 公司研發(fā)的細(xì)胞多色分析技術(shù)居于領(lǐng)先地位，它采用多根激光束同時激發(fā)流動室中的一個細(xì)胞，激發(fā)出來的熒光信號分別經(jīng)過系統(tǒng)中的多個光學(xué)濾光片，被不同的光電檢測器檢測，這樣就可以解決熒光信號重疊的問題，使多色分析達(dá)到最佳效果。BD 產(chǎn)品最多可進(jìn)行15 色熒光分析和前向、側(cè)向散射光分析，這樣單次實驗就可以同時獲得多達(dá)17個參數(shù)，提供豐富的細(xì)胞信息。

　　2.5? 儀器小型化?

　　低功耗、小型化、便攜式的細(xì)胞分析分選儀器，一直都是各大廠商和科研院所的研究方向。隨著激光光源、光電檢測器件、電子計算機等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，器件的性能更加優(yōu)越，體積也更小，這使得流式細(xì)胞儀的小型化取得很大進(jìn)展。目前市場上的 C6 流式細(xì)胞儀的體積比小型微波爐還要小，重量不足 14kg，功耗也不超過 70W，是真正意義上的小型化分析儀器。

　　以 MEMS 技術(shù)（微機電系統(tǒng)）為基礎(chǔ)的微流控芯片（microfluidic chip） 技術(shù)具有體積小、效率高、集成度高、速度快等特點，為生化分析領(lǐng)域開辟新的研究方向。國外課題組在這方面已經(jīng)做很多研究。Hirono 等人采用LED 作光源的微芯片流式細(xì)胞成像分析系統(tǒng)實現(xiàn)對血小板凝集數(shù)量的計數(shù)。Wolff 課題組研制一種微芯片細(xì)胞分選器，他們將激光光源、檢測器件和細(xì)胞的培養(yǎng)室統(tǒng)統(tǒng)集成到一個微型芯片上。該細(xì)胞分選器具有尺寸小、分選效率高、價格低等特點，同時采用封閉體系可以有效防止污染，滿足環(huán)保要求。國內(nèi)方面也有很多課題組從事這方面研究。姚波等人采用靜電力的方法實現(xiàn)對細(xì)胞的篩選。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過檢測區(qū)后，在芯片出樣管道的分支處被施加不同電壓，帶電荷細(xì)胞進(jìn)入出樣管道后，在靜電場力作用下，發(fā)生不同方向的偏轉(zhuǎn)，進(jìn)入到相應(yīng)的收集管里，同時， 為有效消除電滲流影響， 他們還對管壁做涂層處理。

　　2.6? 儀器自動化

　　以往流式細(xì)胞儀的使用都比較繁瑣，使用起來有相當(dāng)?shù)碾y度。隨著計算機技術(shù)、自動控制技術(shù)發(fā)展，目前流式細(xì)胞儀在進(jìn)樣、液流控制、多色熒光分析、細(xì)胞分選和數(shù)據(jù)處理等方面都已經(jīng)實現(xiàn)自動化。例如 BD 公司的FACSAria 細(xì)胞分選儀配備液流自動控制系統(tǒng)和軟件自動清洗程序，實現(xiàn)進(jìn)樣倉自動加壓、自動混勻樣本、自動沖洗進(jìn)樣管路、液滴監(jiān)控、自動檢查堵塞。系統(tǒng)軟件的分選設(shè)定和檢測功能大大簡化操作， 實現(xiàn)細(xì)胞分選的無人操作。

　　3? 流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

　　隨著各種新型的熒光染料和單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，流式細(xì)胞儀在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍得到進(jìn)一步的擴展。目前，基本上能進(jìn)行熒光分子標(biāo)記的細(xì)胞或者亞細(xì)胞微粒都能被流式細(xì)胞儀檢測，下面簡要介紹流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等部分領(lǐng)域的應(yīng)用。

　　3.1? 在細(xì)胞生物學(xué)的應(yīng)用

　　細(xì)胞內(nèi) DNA 的含量在整個細(xì)胞周期內(nèi)隨時都發(fā)生周期性的變化，通過熒光探針對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行測量，能夠有效分析各個時相的細(xì)胞百分比以及 DNA 異倍體。相對于傳統(tǒng)染色體核型分析，流式細(xì)胞儀不僅能夠?qū)崿F(xiàn)染色體分析還能進(jìn)行純化，以獲得克隆實驗所需的染色體。同時， 流式細(xì)胞儀因其具有高效分析和分選能力，在分子遺傳學(xué)中也有大量應(yīng)用，主要是用于研究分離的染色體，以及對特定的染色體進(jìn)行分選。流式細(xì)胞儀在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用相對較晚，但它快速、多參數(shù)測量的特點十分適合解決微生物學(xué)面臨的一些問題。目前，在工業(yè)上流式細(xì)胞儀能夠用于微生物的快速鑒定，例如對自來水中的微生物學(xué)鑒定和控制、對生乳中細(xì)菌總數(shù)的檢測等。

　　流式細(xì)胞儀在臨床醫(yī)學(xué)中最早應(yīng)用于腫瘤學(xué)，主要是通過 DNA 含量和線粒體數(shù)量檢測進(jìn)行癌前病變和早期癌癥的診斷以及化療指導(dǎo)和愈后評估等。流式細(xì)胞儀能夠精確檢測細(xì)胞內(nèi) DNA 含量，可對癌癥的性質(zhì)和發(fā)展趨勢進(jìn)行判斷，利于早期診斷。實際應(yīng)用中需要將實體瘤組織解聚、分散制成單細(xì)胞懸液，并用熒光染料（碘化吡啶PI）染色，對細(xì)胞內(nèi)的 DNA 含量進(jìn)行檢測。同時需要將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成 G1 期、S 期和 G2 期 3 個細(xì)胞亞群，DNA 的含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)，腫瘤的惡性程度和非倍體細(xì)胞有密切關(guān)系。流式細(xì)胞儀還可對惡性腫瘤 DNA 倍體異質(zhì)體進(jìn)行檢測，對患者臨床分期、病理分級、腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要意義。腫瘤早期診斷的一個重要依據(jù)就是 DNA 非整倍體細(xì)胞峰的存在。同時，細(xì)胞的 DNA 倍體分析也能夠用于病人愈后情況的早期判斷。異倍體腫瘤惡變的復(fù)發(fā)率和死亡率都比較高，然而，二倍體和近二倍體腫瘤的愈后狀況明顯比較好。流式細(xì)胞儀除能對癌癥 DNA 含量進(jìn)行分析外，還能夠根據(jù)癌癥 DNA 的分布直方圖變化情況對化療效果進(jìn)行評估，這對于癌癥的化療具有重要的指導(dǎo)意義。

　　3.3? 在免疫學(xué)中的應(yīng)用

　　隨著單克隆抗體技術(shù)、熒光色素技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀以其快速、定量測量的特點，被廣泛應(yīng)用于免疫理論研究和臨床實踐當(dāng)中。通過與熒光抗原抗體結(jié)合，對細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)部的抗原、癌細(xì)胞基因蛋白定量分析，實現(xiàn)細(xì)胞分類和亞群分析，這對于各種血液病、癌癥、B細(xì)胞淋巴瘤的早期診斷和治療以及對人體細(xì)胞免疫功能的評估都具有十分重要的現(xiàn)實意義。通過對患者淋巴細(xì)胞各個亞群數(shù)量的檢測可以了解淋巴細(xì)胞的分化功能，同時，通過對疾病的特異性淋巴細(xì)胞亞群或者細(xì)胞表面標(biāo)記物的存在、缺失和過度表達(dá)等的研究，可以對一些免疫性疾病、 感染性疾病和腫瘤等進(jìn)行早期診斷和治療。 此外，還可以利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行組織相容性抗原群體分析和器官移植和移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測。

　　3.4?在血液學(xué)中的應(yīng)用

　　臨床中通過對外周血 T 淋巴細(xì)胞 、骨髓細(xì)胞表面抗原和細(xì)胞內(nèi)DNA 含量的檢測，可以對包括白血病、淋巴瘤等多種血液病進(jìn)行早期診斷、及時治療和愈后情況的判斷。由于各類血細(xì)胞都具有特異的抗原，流式細(xì)胞儀通過采用特異的抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，結(jié)合熒光染料，就可以測定某個細(xì)胞的多項參數(shù)，準(zhǔn)確地判斷細(xì)胞屬性。流式細(xì)胞儀能夠在患者恢復(fù)期檢測體內(nèi)是否還有殘留的病變細(xì)胞，這對于及早發(fā)現(xiàn)并采取有效措施防止白血病等疾病的復(fù)發(fā)具有極其重要的現(xiàn)實意義。上述應(yīng)用只是流式細(xì)胞儀廣泛應(yīng)用的一個縮影，流式細(xì)胞儀在細(xì)胞凋亡檢測、器官移植、精子性別控制、臨床細(xì)菌學(xué)、植物學(xué)等諸多領(lǐng)域都有十分廣泛的應(yīng)用。可以預(yù)見，隨著激光、探測器、計算機技術(shù)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀也將會有更加廣泛的應(yīng)用前景。