免疫熒光技術的實驗方法及其分類

　　二、熒光抗體染色方法及其分類

　　1.直接染色法

　　將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標本對照，抑制試驗對照。

　　2.間接染色法

　　如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，作用一定時間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標本反應，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結合，形成抗原-抗體-抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

　　由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其他動物來制備。

　　間接染色法的優(yōu)點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應設陰、陽性標本對照，還應設有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。

　　3.抗補體染色法

　　抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標記的抗體和補體加在抗原標本上，使其發(fā)生反應，水洗，然后再加標記的抗補體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應，形成復合物，則補體便被抗原抗體復合物結合，第二步加入的熒光素標記的抗補體抗體便與補體發(fā)生特異性反應，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發(fā)出熒光。

　　抗補體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點，此外，還有其獨特的優(yōu)點：即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統(tǒng)。因為補體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應。它的缺點是參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。

　　除上述三種方法外，還有在此基礎上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等。