復(fù)旦校友揭開二十年來(lái)“不明”機(jī)理，獲得穩(wěn)定的DNA損傷反應(yīng)與修復(fù)核心激酶抑制劑，為相關(guān)抗癌****設(shè)計(jì)指明方向

他本科就讀于復(fù)旦大學(xué)，期間參加復(fù)旦和伯明翰大學(xué)的“2+2”聯(lián)合培養(yǎng)，獲一等榮譽(yù)學(xué)位畢業(yè)后，赴劍橋大學(xué)攻讀博士學(xué)位，師從生物化學(xué)系教授湯姆·布倫德爾爵士（Sir Tom Blundell）。博士畢業(yè)以來(lái)，一直在該課題組留任博后。
布倫德爾爵士是全球結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白晶體學(xué)的先驅(qū)之一，亦是最早運(yùn)用蛋白結(jié)構(gòu)和生物信息分析來(lái)指導(dǎo)小分子****物開發(fā)設(shè)計(jì)和優(yōu)化的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家。他于 1984 年當(dāng)選英國(guó)皇家學(xué)會(huì)會(huì)員，1996 年到 2009 年擔(dān)任劍橋大學(xué)生物化學(xué)系主任，曾任英國(guó)科學(xué)委員會(huì)主席。

2022 年 1 月 5 日，由梁世康和布倫德爾擔(dān)任共同通訊作者的論文，以題為《DNA修復(fù)蛋白 DNA-PKcs 抑制劑調(diào)控的結(jié)構(gòu)見解》（Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs）發(fā)表在 Nature[1]。
梁世康指出，過去二十年以來(lái)學(xué)術(shù)界和制****界一直未能很清楚了解的小分子抑制劑和人體 DNA 損傷修復(fù)核心蛋白激酶（DNA-PKcs）的作用機(jī)理。
論文揭示了相關(guān)機(jī)理分子水平的細(xì)節(jié)，這為相關(guān)抗癌****物的設(shè)計(jì)提供了明確方向指導(dǎo)，也揭示了配體結(jié)合對(duì)于 DNA-PKcs 后續(xù)催化反應(yīng)的促進(jìn)效果，同時(shí)在基于結(jié)構(gòu)的****物開發(fā)和設(shè)計(jì)上再次展現(xiàn)出冷凍電鏡的重要潛力。

DNA 依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）在非同源端連接中起著重要作用，這是人類檢測(cè)和修復(fù) DNA 雙鏈斷裂（DSBs）的兩種主要途徑之一。

DNA-PKcs 在修復(fù)病理性 DSBs 中具有重要作用，結(jié)合 DSBs 誘導(dǎo)的放療和化療，DNA-PKcs 抑制劑已成為很有吸引力的癌癥治療****物。目前，已開發(fā)的許多 DNA-PKcs 選擇性抑制劑在治療各種癌癥方面具有潛力。

該研究報(bào)道了從 HeLa 細(xì)胞核提取物中純化的天然人類 DNA-PKcs 與不同配體復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)。這些配體包括腺苷-5'-（-硫代）-三磷酸鹽（ATPγS）和四種抑制劑（渥曼青霉素、NU7441、AZD7648 和 M3814），其中包括正在進(jìn)行臨床 I、II 試驗(yàn)的候選****物。

而該結(jié)構(gòu)揭示了配體在 ATP 位點(diǎn)結(jié)合的分子細(xì)節(jié)，并提供了對(duì)競(jìng)爭(zhēng)抑制劑的作用模式和特性的見解。值得注意的是，配體的結(jié)合導(dǎo)致 PIKK 調(diào)控域（PRD）發(fā)生移動(dòng)，揭示了 p 環(huán)和 PRD 構(gòu)象之間的連接。

電泳遷移率測(cè)定和 cryo-EM 對(duì) DNA 依賴蛋白激酶全酶的研究進(jìn)一步表明，配體結(jié)合對(duì)全酶復(fù)合物的組裝沒有負(fù)面的變構(gòu)或抑制作用，抑制劑通過與 ATP 直接競(jìng)爭(zhēng)發(fā)揮作用。

作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)控者， 蛋白激酶的相關(guān)制****在各個(gè)疾病領(lǐng)域尤其是癌癥上，展現(xiàn)出驚人療效和巨大潛力。

DNA-PKcs 作為人體 DNA 損傷反應(yīng)與修復(fù)的核心激酶，更是延緩和治療癌癥的重要靶點(diǎn)。抑制 DNA-PKcs 活性可以阻斷相關(guān) DNA 修復(fù)通路，加速紊亂癌細(xì)胞的基因組來(lái)殺死癌細(xì)胞。

此外，對(duì)于通過破壞癌細(xì)胞基因組穩(wěn)定來(lái)殺死癌細(xì)胞的治療方式、比如放療和化療來(lái)說，抑制 DNA-PKcs 活性還能加強(qiáng)治療效果。

因此，學(xué)術(shù)界和制****界一直在針對(duì) DNA-PKcs 的抑制劑進(jìn)行研發(fā)。尤其是制****公司通過高通量篩選和****物分子優(yōu)化設(shè)計(jì)，開發(fā)出了第一代和第二代特異性抑制劑，并已有數(shù)個(gè)小分子****物進(jìn)入臨床 I、II 期試驗(yàn)。

然而，因?yàn)榈鞍鬃陨泶笮?、靈活度、穩(wěn)定性和取向偏好等因素，在晶體時(shí)代和自冷凍電鏡革命以來(lái)，其相關(guān)結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展緩慢，一直無(wú)法獲得蛋白和抑制劑相互作用的高分辨率結(jié)構(gòu)信息。

基于該問題，梁世康運(yùn)用冷凍電鏡，在添加自制單層氧化石墨烯薄膜作為基底和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件之后，獲得了穩(wěn)定的 DNA-PKcs/抑制劑復(fù)合物，并解析出了相關(guān)高解析度結(jié)構(gòu)。

通過天然配體/廣譜抑制劑/第一、二代特異性抑制劑，與 DNA-PKcs 相互作用機(jī)理的縱向比較，結(jié)合其同源激酶家族成員、與配體和抑制劑相互作用機(jī)理的橫向比較，他們首次得以從分子層面闡釋 DNA-PKcs 抑制劑特異性差異的原因，并為新一代抑制劑的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了指導(dǎo)思路。


不僅如此，各種配體在同一結(jié)合位點(diǎn)的不同作用方式，也揭示出 DNA-PKcs 催化中心內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同運(yùn)動(dòng)，展現(xiàn)出配體對(duì)底物結(jié)合的促進(jìn)作用，這也幫助梁世康進(jìn)一步了解相關(guān)催化機(jī)理。

總的來(lái)說，該研究中描述的結(jié)構(gòu)將極大地幫助未來(lái)靶向 DNA-PKcs 的合理****物設(shè)計(jì)，展示 cryo-EM 在結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的大型和挑戰(zhàn)性目標(biāo)****物開發(fā)中的潛力。

選擇和努力一樣重要，這同樣適用于科研圈。正因?yàn)榱菏揽颠x擇了布倫德爾，布倫德爾選擇了他，才有了今天的成果。

多年以來(lái)，布倫德爾教授持續(xù)關(guān)注研究人體 DNA 雙鏈斷裂修復(fù)的相關(guān)結(jié)構(gòu)機(jī)理。2001 年，該實(shí)驗(yàn)室開始 DNA-PKcs 相關(guān)的結(jié)構(gòu)研究，2009 年率先得到 DNA-PKcs 的晶體，并解析出 6.6? 的蛋白結(jié)構(gòu) [2]。

2017 年，在優(yōu)化結(jié)晶條件和使用硒代蛋氨酸標(biāo)記的基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)成功解析出 4.3? 的晶體結(jié)構(gòu)，成功提出第一個(gè) DNA-PKcs 的原子結(jié)構(gòu)模型[3]。

梁世康回憶稱，剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室讀博時(shí)，他的課題是運(yùn)用晶體衍射的方法，來(lái)研究包括蛋白-蛋白和蛋白-配體在內(nèi)的、與 DNA-PKcs 相關(guān)的蛋白復(fù)合物。

但是由于相關(guān)蛋白表達(dá)難、無(wú)序度高、穩(wěn)定性低、提純復(fù)雜以及產(chǎn)量低，結(jié)晶難等一系列挑戰(zhàn)因素，讓其早期研究進(jìn)展非常緩慢。

他說：“有時(shí)做了整整一周的蛋白純化，卻只能拿到幾百微克的蛋白樣品，只夠測(cè)試和優(yōu)化很少的實(shí)驗(yàn)條件?！?br />
在不停做實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，他也不斷地跟導(dǎo)師、實(shí)驗(yàn)室前輩和同事探討，并通過閱讀文獻(xiàn)不斷“充電”。在導(dǎo)師的信任和支持下，他積極拓展研究方法，開始運(yùn)用冷凍電鏡單顆粒技術(shù)。

其表示：“讓我很難忘的，是解出 DNA-PKcs/NU7441 復(fù)合物結(jié)構(gòu)也是第一個(gè) DNA-PKcs / 配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的那天晚上。”
不同于多蛋白組分復(fù)合物可在電鏡下、或二維投影里直接看出結(jié)合伴侶是否存在，因?yàn)榕潴w是小分子，在得到三維結(jié)構(gòu)之前，很難判斷其是否作用在結(jié)合位點(diǎn)上。

由于之前不少嘗試都不盡如人意，在計(jì)算機(jī)上分析這套數(shù)據(jù)時(shí)，梁世康已經(jīng)開始思考接下來(lái)可行的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和具體安排。

而在得到三維結(jié)構(gòu)之后，當(dāng)他在結(jié)合位點(diǎn)里清楚看到來(lái)自配體的信號(hào)的那一刻，他十分欣喜，這意味著能以此為基礎(chǔ)，來(lái)研究其他特異性不同的抑制劑和 DNA-PKcs 的相互作用。

對(duì)于該研究的應(yīng)用價(jià)值，他說：“最直接、最明顯快速的應(yīng)用前景，在于可指導(dǎo)新一代針對(duì) DNA-PKcs 的小分子激酶抑制劑的設(shè)計(jì)。”

在獲悉抑制劑和蛋白的作用機(jī)理，也通過一系列橫向與縱向?qū)Ρ龋宄种苿┨禺愋缘膩?lái)源之后，即可結(jié)合生物信息分析****物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性，去設(shè)計(jì)特異性更好、與結(jié)合位點(diǎn)更適配的小分子抑制劑。

說到這里他表示：“我們發(fā)表并公開了所有相關(guān)結(jié)構(gòu)，這樣不僅是我們課題組，全世界其他研究小組和制****公司都可使用此次發(fā)布的結(jié)構(gòu)信息，來(lái)優(yōu)化和指導(dǎo)已有小分子****物。雖然離讓廣大病患使用到具體****物還有很長(zhǎng)一段路，但這無(wú)疑可以加速相關(guān)抗癌****物的研發(fā)，助力未來(lái)造福患者?！?br />
不僅如此，該研究也是一個(gè)很好的概念驗(yàn)證，對(duì)于 DNA-PKcs 這種頗具挑戰(zhàn)性的蛋白來(lái)說，證明了運(yùn)用冷凍電鏡來(lái)做基于結(jié)構(gòu)的****物設(shè)計(jì)是可行的。

除傳統(tǒng)小分子激酶抑制劑和****物靶點(diǎn)之外，借助該研究也可關(guān)注其他類型****物 ，比如蛋白降解靶向嵌合體、以及多肽和其他結(jié)合位點(diǎn)。
相比目前已成熟的傳統(tǒng)激酶抑制劑研究，盡管這些發(fā)展和應(yīng)用更加耗時(shí)耗力，成本也相對(duì)高昂，但是****物發(fā)展充滿各種可能性，值得積極嘗試。

接下來(lái)，梁世康也會(huì)牽手合作團(tuán)隊(duì)，探究新一代抑制劑的優(yōu)化，以追求更好的特異性和結(jié)合強(qiáng)度，并將繼續(xù)深耕人體 DNA 損傷反應(yīng)與修復(fù)以及相關(guān)新型****物分子的開發(fā)。

-End-
參考：
1、Liang, S. et al. Structural insights into inhibitor regulation of the DNA repair protein DNA-PKcs. Nature (2022) DOI: 10.1038/s41586-021-04274-9
2、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., & Blundell, T. L. Crystal structure of DNA-PKcs reveals a large open-ring cradle comprised of HEAT repeats." Nature 463.7277 (2010): 118-121.
3、Sibanda, B. L., Chirgadze, D. Y., Ascher, D. B., & Blundell, T. L. DNA-PKcs structure suggests an allosteric mechanism modulating DNA double-strand break repair. Science（2017）：355(6324), 520-524.