專(zhuān)訪蔡孟浩丨華東理工團(tuán)隊(duì)歷時(shí)八年三次迭代改造畢赤酵母，開(kāi)發(fā)即插即用通用型平臺(tái)，有望產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

生物制****和制造行業(yè)需要高水平和可控的基因表達(dá)來(lái)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。如何設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)兼具高表達(dá)強(qiáng)度和靈活調(diào)控特性的新型表達(dá)系統(tǒng)，是生物工程和合成生物技術(shù)所面臨的關(guān)鍵問(wèn)題和重要目標(biāo)之一。

酵母作為人們熟知的真核微生物，在食****方面的應(yīng)用已有悠久的歷史，在現(xiàn)代蛋白生產(chǎn)和生物合成方面也有非常廣泛的應(yīng)用。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母 —— 巴斯德畢赤酵母，因其生長(zhǎng)密度高、蛋白表達(dá)強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定好和糖基化修飾溫和等優(yōu)點(diǎn)，在學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)中均展現(xiàn)了很好的應(yīng)用效果，已成為重組蛋白表達(dá)的優(yōu)選底盤(pán)細(xì)胞。
然而，畢赤酵母作為一種非模式生物體，其強(qiáng)啟動(dòng)子種類(lèi)和數(shù)量有限，且多基于甲醇誘導(dǎo)特性，在工業(yè)設(shè)施安全和食品應(yīng)用安全方面存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，這些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式單一，多受發(fā)酵碳源的嚴(yán)格阻遏，使大宗蛋白或化學(xué)品生產(chǎn)中的底物譜受限，很大程度上限制了其在更廣闊場(chǎng)景下的應(yīng)用潛力。
近日，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院蔡孟浩課題組在新型酵母表達(dá)設(shè)計(jì)方面取得重要進(jìn)展，開(kāi)發(fā)了可響應(yīng)用戶(hù)自定義信號(hào)的高效畢赤酵母蛋白表達(dá)平臺(tái)，相關(guān)成果已在線發(fā)表于 Science Advances 上。
可響應(yīng)用戶(hù)自定義信號(hào)：
只需找到已報(bào)道的、或用戶(hù)自定義篩選條件通過(guò)組學(xué)篩選的低強(qiáng)度啟動(dòng)子，即可接入 SynPic-X 平臺(tái)（高效表達(dá)的畢赤酵母平臺(tái)）實(shí)現(xiàn)響應(yīng)用戶(hù)自定義條件的高效表達(dá)。理論上，通過(guò)目前的測(cè)序和組學(xué)技術(shù)，較易篩選獲得低強(qiáng)度啟動(dòng)子。

借此機(jī)會(huì)，生輝 SynBio 邀請(qǐng)到了蔡孟浩來(lái)與我們分享他的研究進(jìn)展。
圖丨蔡孟浩（來(lái)源：受訪者提供）
蔡孟浩本科畢業(yè)于華東理工大學(xué)理工優(yōu)秀生部，隨后保研到華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院張?jiān)d教授和周祥山教授課題組進(jìn)行碩博連讀，期間還前往英國(guó)布里斯托大學(xué)化學(xué)院 Russell J. Cox 教授課題組進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，開(kāi)展真菌聚酮****物的組合生物合成及發(fā)酵工程研究?，F(xiàn)為華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院副教授、博士生導(dǎo)師、生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 PI，獲得國(guó)家高層次特殊支持計(jì)劃青年拔尖人才、上海市青年科技啟明星計(jì)劃資助。
“盡管組合生物合成是合成生物學(xué)的方向之一，但其化學(xué)學(xué)科屬性更強(qiáng)，因此上學(xué)期間我對(duì)合成生物學(xué)并不了解。直到 2014 年參加了冷泉港亞洲合成生物學(xué)國(guó)際會(huì)議，在聆聽(tīng)麻省理工學(xué)院 Christopher Voigt 教授的 “Programming cells as a placeholder” 主題演講后，如醍醐灌頂，決定融合以往的科研經(jīng)歷，開(kāi)設(shè)合成生物學(xué)研究方向。”
目前，其主要研究方向聚焦畢赤酵母新型細(xì)胞工廠創(chuàng)制與應(yīng)用，包括特色酵母元器件設(shè)計(jì)、新型酵母底盤(pán)開(kāi)發(fā)、重組蛋白表達(dá)及天然產(chǎn)物合成應(yīng)用。
即插即用的新型酵母表達(dá)平臺(tái)
“畢赤酵母作為底盤(pán)細(xì)胞，在工業(yè)中廣泛用于蛋白表達(dá)，但表達(dá)過(guò)程中需要一個(gè)強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這個(gè)菌常用的 P_AOX1（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子雖強(qiáng)度較強(qiáng)，但嚴(yán)謹(jǐn)性也高，有且只有甲醇存在的條件下，才能誘導(dǎo)開(kāi)啟，若混雜其他碳源，就會(huì)產(chǎn)生阻遏而無(wú)法表達(dá)，因此使用場(chǎng)景相對(duì)較窄，產(chǎn)品體量較小?！?蔡孟浩說(shuō)道。
隨著工業(yè)生物技術(shù)體系快速發(fā)展，未來(lái)生物制造的體系需做到很大規(guī)模。但畢赤酵母僅能利用甲醇進(jìn)行高效誘導(dǎo)表達(dá)的特性存在三方面的問(wèn)題。其一，甲醇具有毒性，大規(guī)模生物制造時(shí)考慮成本問(wèn)題產(chǎn)品往往無(wú)法做到很精細(xì)的純化，比如若用于制造食品，則會(huì)給人體帶來(lái)傷害；其二，甲醇易燃易爆，大規(guī)模生物制造使用時(shí)的安全性仍需評(píng)估；其三，大規(guī)模應(yīng)用需考慮成本問(wèn)題，低成本意味著工業(yè)發(fā)酵時(shí)復(fù)合原料底物可能會(huì)混有多種阻遏碳源，這會(huì)阻遏畢赤酵母對(duì)甲醇的代謝利用，并且與其只能在甲醇存在的條件下誘導(dǎo)表達(dá)相矛盾。
“基于這三方面問(wèn)題，我們希望畢赤酵母作為底盤(pán)細(xì)胞既能保持它的強(qiáng)表達(dá)優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也具有較強(qiáng)魯棒性?！币虼?，蔡孟浩課題組歷時(shí)八年對(duì)畢赤酵母進(jìn)行三代改造，使其能突破單一甲醇誘導(dǎo)的高效表達(dá)蛋白。
他介紹道，第一代體系主要解決的是畢赤酵母甲醇調(diào)控過(guò)于嚴(yán)謹(jǐn)問(wèn)題，通過(guò)解析誘導(dǎo)甲醇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，找到一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子與其他幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)甲醇信號(hào)過(guò)程中存在級(jí)聯(lián)傳遞機(jī)制。基于此機(jī)制，對(duì)畢赤酵母進(jìn)行了代謝工程層面的改造。簡(jiǎn)單改造后能夠讓畢赤酵母實(shí)現(xiàn)部分甲醇誘導(dǎo)的碳源脫阻遏，可以用葡萄糖和甘油產(chǎn)生類(lèi)似誘導(dǎo)的效應(yīng)，但表達(dá)能力沒(méi)有甲醇強(qiáng)。
為解決此問(wèn)題，蔡孟浩課題組利用合成生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單遺傳線路，最核心的是通過(guò)人工設(shè)計(jì)的方式讓激活因子更好地結(jié)合啟動(dòng)子，激發(fā)其表達(dá)，改造之后的第二代體系表達(dá)強(qiáng)度得到提升。但由于轉(zhuǎn)錄放大效應(yīng)，滲漏表達(dá)也提高了。在工業(yè)生產(chǎn)中，畢赤酵母生長(zhǎng)階段盡量不期望出現(xiàn)產(chǎn)物的合成，否則會(huì)給細(xì)胞代謝帶來(lái)較重負(fù)擔(dān)，最終影響生物量和產(chǎn)物量。
因此第三代要解決的是進(jìn)一步去除滲漏表達(dá)問(wèn)題，同時(shí)保持畢赤酵母很高的表達(dá)強(qiáng)度。蔡孟浩課題組通過(guò)分析畢赤酵母天然轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并重塑轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)器，設(shè)計(jì)了一套具有高強(qiáng)度表達(dá)能力的轉(zhuǎn)錄信號(hào)增益器件 iTSAD，實(shí)現(xiàn)輸入信號(hào)的高效放大，達(dá)到商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 表達(dá)強(qiáng)度的 5.2 倍。
同時(shí)，針對(duì)其介導(dǎo)的滲漏表達(dá)水平較高的問(wèn)題，基于 CRISPR 基因調(diào)控技術(shù)，設(shè)計(jì) CRISPRi 阻遏器件以解決高滲漏表達(dá)問(wèn)題，并設(shè)計(jì) CRISPRa 激活器件以抵消 CRISPRi 的高限表達(dá)壓制，以此可響應(yīng)靈活、低強(qiáng)度輸入信號(hào)而協(xié)同控制 iTSAD 器件，有效解決高滲漏表達(dá)問(wèn)題，并通過(guò)對(duì)引導(dǎo) RNA 組合的理性設(shè)計(jì)和篩選驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)完整系統(tǒng)的高強(qiáng)度表達(dá)輸出。
圖 A丨響應(yīng)自定義信號(hào)的合成型畢赤酵母平臺(tái)（SynPic-X）的開(kāi)發(fā)
由此，最終開(kāi)發(fā)成功具有高強(qiáng)度、低滲漏、可編程特性的合成型畢赤酵母表達(dá)平臺(tái) SynPic-X?！斑@是一個(gè)通用型的高強(qiáng)度、可編程平臺(tái)，通過(guò)簡(jiǎn)單地 “插拔” 已知的或簡(jiǎn)單組學(xué)篩選的單一低輸入啟動(dòng)子即可實(shí)現(xiàn)響應(yīng)用戶(hù)自定義信號(hào)的高水平蛋白表達(dá)和嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控。”
有望產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用
目前，針對(duì)該表達(dá)平臺(tái)，蔡孟浩團(tuán)隊(duì)輸入了不同類(lèi)型的啟動(dòng)子進(jìn)行檢驗(yàn)，分別構(gòu)建了鼠李糖信號(hào)響應(yīng)系統(tǒng) SynPic-R、甲醇信號(hào)響應(yīng)系統(tǒng) SynPic-M 和硫胺素信號(hào)響應(yīng)系統(tǒng) SynPic-T，均可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定信號(hào)的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控和高效響應(yīng)，在激活狀態(tài)下分別達(dá)到商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 表達(dá)強(qiáng)度的 3.8 倍、4.4 倍和 3.3 倍。
為了測(cè)試 SynPic-X 平臺(tái)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和潛力，蔡孟浩團(tuán)隊(duì)還選取鼠李糖信號(hào)響應(yīng)系統(tǒng) SynPic-R 用于驅(qū)動(dòng)工業(yè)淀粉酶的表達(dá)，在 3 升反應(yīng)器水平得到了與商業(yè)化畢赤酵母 P_AOX1 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)量，且生產(chǎn)工藝控制更為綠色、安全、簡(jiǎn)便，展現(xiàn)了良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
（來(lái)源：受訪者）
“下一步我們將繼續(xù)升級(jí)畢赤酵母細(xì)胞工廠，主要包括兩個(gè)方面，其一是設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)多底物協(xié)同利用型底盤(pán)，以滿足大規(guī)模蛋白及天然產(chǎn)物制造的低成本、高魯棒性需求；其二是設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)翻譯后修飾定制型底盤(pán)，以滿足動(dòng)植物源****用活性分子的高活性和高效生物合成需求。”
除了畢赤酵母發(fā)酵平臺(tái)，蔡孟浩團(tuán)隊(duì)還建有絲狀真菌和大腸桿菌發(fā)酵平臺(tái)體系，其中，畢赤酵母發(fā)酵平臺(tái)主要針對(duì)重組蛋白及小分子****物、新型食品替代蛋白；絲狀真菌發(fā)酵平臺(tái)主要針對(duì)天然****物及色素；大腸桿菌發(fā)酵平臺(tái)主要針對(duì)特殊功能酶等。
蔡孟浩說(shuō)道，“我們前期開(kāi)發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)及蛋白****物表達(dá)應(yīng)用已經(jīng)實(shí)現(xiàn)企業(yè)轉(zhuǎn)讓?zhuān)瑫r(shí)在新型替代蛋白、抗衰****物開(kāi)發(fā)方面也在與企業(yè)開(kāi)展密切的研發(fā)合作，有望在 1~2 年內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。”
采訪最后，蔡孟浩老師也向我們分享了他的科研經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)學(xué)生的心得體會(huì)，他認(rèn)為研究要 “博觀約取”，廣泛汲取新學(xué)術(shù)思想和技術(shù)方法，但也要以應(yīng)用出口為導(dǎo)向進(jìn)行謹(jǐn)慎選取和融合，基于此的 “機(jī)制 - 重構(gòu) - 應(yīng)用” 研究思路和目標(biāo)會(huì)更加明確，適合應(yīng)用基礎(chǔ)研究體系。
在培養(yǎng)學(xué)生方面，要引導(dǎo)（建立思路）、鼓勵(lì)（提升信心）、敦促（增強(qiáng)動(dòng)力）相結(jié)合，這對(duì)于學(xué)生的獨(dú)立和快速成長(zhǎng)非常重要。
參考資料：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl5166

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