哈佛團(tuán)隊(duì)開發(fā)小分子化合物篩選新策略，可直接靶向非編碼RNA，專家解讀：成****還有很長的路要走

一直以來，蛋白質(zhì)類靶點(diǎn)在傳統(tǒng)小分子****物中占據(jù)著絕對的領(lǐng)導(dǎo)地位，盡管人類基因組中 98% 的 核苷酸序列產(chǎn)生的RNA 并不會翻譯為蛋白質(zhì)。也就是說，即使整個蛋白質(zhì)組中僅有一小部分可以作為****物的靶標(biāo)，RNA 也并未成為****物開發(fā)選擇的主流靶標(biāo)。業(yè)界普遍認(rèn)為，以具有穩(wěn)定形狀和構(gòu)象的蛋白質(zhì)為依據(jù)開發(fā)相應(yīng)的****物更為安全、有效。

然而，隨著越來越多的疾病被歸因于非編碼 RNA，以及科學(xué)界對 RNA 的研究不斷加強(qiáng)，以 RNA 作為靶點(diǎn)的可行性不斷被證實(shí)。近 10 年來，以 RNA 作為靶標(biāo)進(jìn)行小分子****物開發(fā)的****企也逐漸增多。

哈佛醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教授 Jeannie Lee 表示，“非編碼 RNA 在基因組中發(fā)揮著非常重要的作用，我們了解到，非編碼空間中的突變會導(dǎo)致疾病，而且非編碼 RNA 的數(shù)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于蛋白質(zhì)編碼基因。如果有能夠靶向這些 RNA 的方式，將極大擴(kuò)展我們可以找到治療患者****物的領(lǐng)域?！?/span>

不過，目前全球獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物仍是屈指可數(shù)。其中， 2020 年 FDA 批準(zhǔn)上市的脊髓性肌萎縮癥****物 evrysdi，為首個獲批上市的靶向 RNA 的小分子****物。

然而，“當(dāng)前已經(jīng)證明可以靶向 RNA 的小分子****物如 evrysdi、linezolid、ribocil、branaplam 等都是通過表型篩選的手段發(fā)現(xiàn)，后續(xù)通過實(shí)驗(yàn)證明是靶向 RNA。”ReviR（溪礫科技）聯(lián)合創(chuàng)始人、董事長李陽博士告訴生輝。

可以說，對于加快靶向 RNA ****物的發(fā)現(xiàn)尚需一種可擴(kuò)展的、直接發(fā)現(xiàn)靶向 RNA 的化合物分子篩選方法。對此，Jeannie Lee 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種可直接篩選靶向非編碼 RNA 的小分子化合物的策略，并且他們使用該方法證明了篩選出的小分子化合物可與名為 Xist 的非編碼 RNA 結(jié)合。相關(guān)論文于近日發(fā)表在 Nature 上。

（來源：Nature）

“該研究的關(guān)鍵突破是找到并且證明了一種新的靶向 RNA 小分子化合物的篩選方法，而且，他們證明了這種小分子化合物是直接作用于 Xist 的，而非其所表達(dá)的蛋白。”新加坡國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院助理教授史家海告訴生輝。

非編碼 RNA Xist 是一種使X染色體失活的關(guān)鍵分子，Xist 上富含 GC 序列的區(qū)域 RepA 主要負(fù)責(zé)基因沉默，RepA 異常導(dǎo)致X 染色體未失活將引發(fā)相應(yīng)的遺傳疾病。

在 Jeannie Lee 團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證其設(shè)計(jì)的篩選靶向 RNA 的小分子化合物方法中，以 Xist 為靶點(diǎn)展開，并且為首個靶向Xist化合物的高通量篩選方案。

該團(tuán)隊(duì)基于親和質(zhì)譜技術(shù)設(shè)計(jì)了一種無偏方法，使用已應(yīng)用于蛋白質(zhì)篩選的 ALIS 系統(tǒng)進(jìn)行靶向 RNA 的小分子化合物篩選，這一系統(tǒng)可自動識別親和力大于 10μM 的可逆性結(jié)合配體。

具體而言，該團(tuán)隊(duì)利用這一方法在默克的包含 5 萬種小分子化合物的文庫中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了 20 個表現(xiàn)出合理****物特性的化合物，有 15 個展現(xiàn)出了與配體較強(qiáng)的親和力。

其中，具有吲唑-苯并咪唑支架獨(dú)特構(gòu)象的化合物 X1 為與配體結(jié)合親和力最強(qiáng)的一個，且對 RepA 具有高度的特異選擇性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證其篩選出的化合物 X1 對 RepA 功能的影響，該團(tuán)隊(duì)將 X1 與促進(jìn) Xist 傳播、沉默 X 染色體的同源蛋白 RepA RNA、PRC2 以及 SPEN-RRM 的相互作用進(jìn)行了檢測。測試結(jié)果顯示，在 X1 的作用下，RepA 與同源蛋白之間的相互作用逐漸受到影響（下圖f）。并且，相互作用的希爾系數(shù)為 1.4-1.5，這表明 X1 在影響 RepA 功能過程中可能會發(fā)揮協(xié)同作用，即不止一個 X1 分子與 RepA 結(jié)合。

（來源：Nature）

“這一研究表明，通過高通量手段直接篩選 RNA 結(jié)合的小分子已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)。”李陽說道。

對于這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，李陽總結(jié)了兩個重要的意義：

第一，小分子靶向 RNA 被證明可行?！岸疫@次他們選擇的是非編碼 RNA 作為靶點(diǎn)來篩選化合物，預(yù)示著非編碼 RNA 也能成為制****靶點(diǎn)來開發(fā)****物，更加拓寬了 RNA 制****領(lǐng)域的范圍，將使得傳統(tǒng)認(rèn)為不可靶向的靶點(diǎn)可以進(jìn)一步被挖掘?！崩铌栒f道。

就現(xiàn)階段而言，溪礫科技也已經(jīng)開始針對 ncRNA 以及 mRNA 靶點(diǎn)進(jìn)行小分子****物篩選。

第二，表明了可以通過一些高通量手段來直接篩選 RNA 結(jié)合的小分子，其他的如 DNA 編碼化合物庫（DEL）也逐漸被應(yīng)用。

對此，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院于文強(qiáng)教授也表達(dá)了類似的觀點(diǎn)。他表示這篇研究主要貢獻(xiàn)在于證明了小分子靶向 RNA 的可行性，“其采用一種小分子****物，來打開或改變 RNA 的二級結(jié)構(gòu)，換句話說，RNA 序列雖然結(jié)合在位置上，但是后續(xù)因?yàn)樾》肿痈深A(yù)導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)變化而沒有相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)合，最終也發(fā)揮不了作用?！?/span>

（來源：Pixabay）

人類基因組中的絕大多數(shù) RNA 是非編碼的，非編碼 RNA 的不穩(wěn)定性使得制****公司不愿意開發(fā)靶向它的****物。于文強(qiáng)則認(rèn)為，“并非因?yàn)榉蔷幋a RNA 不穩(wěn)定而不去開發(fā)****物，非編碼 RNA 作為****物的靶點(diǎn)，其主要問題是機(jī)制和下游靶點(diǎn)十分不明確，而且毒性太強(qiáng)，盡管該問題目前已經(jīng)得到部分解決。”

據(jù)介紹，在制****領(lǐng)域，相較于以蛋白質(zhì)作為靶點(diǎn)進(jìn)行****物開發(fā)，將 RNA 作為靶點(diǎn)存在一些不足，比如，RNA 結(jié)構(gòu)相對蛋白質(zhì)簡單，需要解決靶點(diǎn)特異性問題；而且小分子與 RNA 靶點(diǎn)結(jié)合較弱。

當(dāng)然，將 RNA 作為靶點(diǎn)也有優(yōu)勢，比如蛋白層面不可成****靶點(diǎn)可以被靶向，同一個基因存在多個潛在 RNA 靶點(diǎn)，并且存在大量可成****機(jī)制可以被探索，如 ribotac。

關(guān)于****物靶點(diǎn)的選擇，李陽指出，其與具體機(jī)制相關(guān)，一些可選的策略與蛋白靶點(diǎn)類似，比如，選擇具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)或者高質(zhì)量結(jié)合口袋的 RNA motif；靶向 RNA-蛋白相互作用（branaplam、risdiplam）；調(diào)控 mRNA 可變剪切的 motif。

于文強(qiáng)認(rèn)為，“RNA 存在兩個維度，一個是結(jié)構(gòu)，一個是序列。不論是 RNA ****物還是蛋白質(zhì)****物，其靶點(diǎn)要么是針對結(jié)構(gòu)、要么是針對序列?！贬槍@種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的****物，有一些成功的案例。

“RNA 通過堿基互補(bǔ)配對，極容易受到環(huán)境的影響，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)極其不穩(wěn)定，這也就意味著 RNA 的結(jié)構(gòu)是高度動態(tài)的，是很難預(yù)測的?！庇谖膹?qiáng)說道，“RNA ****物應(yīng)該是以 RNA 序列靶向?yàn)橹鞯陌l(fā)展。”

“RNA ****物目前很少，原因在于 RNA ****物進(jìn)入體內(nèi)會觸發(fā)免疫反應(yīng)，雖然在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞環(huán)境中效果較好，但是一旦進(jìn)入臨床試驗(yàn)便會出現(xiàn)免疫反應(yīng)和毒副作用等?！彼a(bǔ)充說。但隨著mRNA疫苗的應(yīng)用，其毒副作用問題將不再是一個瓶頸問題。

（來源：Pixabay）

但從這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)到真正能夠?qū)崿F(xiàn)將 RNA 作為靶點(diǎn)開發(fā)****物，還有很長的路要走。

在李陽看來，具體還需要克服兩大難題：其一，尋找特異性的 RNA 靶點(diǎn)；其二，擴(kuò)展靶向 RNA 特異性結(jié)構(gòu)的小分子庫。“這項(xiàng)研究的命中率極低，我們需要更多知識來定義哪些小分子更可能靶向 RNA，目前我們知之甚少，但高通量測序/實(shí)驗(yàn)+AI 是很有潛力的解決方案?！崩铌栒f道。

“我了解到的，其實(shí) RNA 靶向的小分子****物開發(fā)已經(jīng)興起快 20 年了，最近 10 年非常熱門。想要將 RNA 作為靶點(diǎn)開發(fā)****物，也需要重點(diǎn)解決脫靶效應(yīng)。因?yàn)?RNA 和 RNA 之間非常類似，而小分子所能覆蓋的長度又不夠，所以很容易出現(xiàn)脫靶問題?！笔芳液Ｖ赋觥?/span>