科學(xué)家研發(fā)新型熒光探針，通過熒光蛋白與阿片受體融合實時監(jiān)控阿片肽結(jié)合過程，可用于疼痛管理和成癮治療
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圖 | 董春陽（來源：董春陽）據(jù)介紹，本次研究的核心思想在于：將熒光蛋白與阿片受體融合，通過受體構(gòu)象變化引起的熒光信號變化，來實時地反映阿片肽的結(jié)合過程。
期間，董春陽等人針對三種主要的阿片受體亞型——κ 受體、δ 受體和 μ 受體，分別設(shè)計了相應(yīng)的熒光探針 κLight、δLight 和 μLight。
這樣一來，不僅可以區(qū)分不同類型的阿片肽，還能在單個細胞水平上實現(xiàn)高時空分辨率的信號檢測。
（來源：Nature Neuroscience）通過開發(fā)和應(yīng)用新型熒光探針，本次研究旨在從多個層面，深入探索阿片肽系統(tǒng)的功能和調(diào)控機制。
這不僅能幫助人們理解阿片系統(tǒng)在情感行為和動機行為中的作用，還可能為理解和治療相關(guān)精神疾病提供新見解。
通過研究分子水平的受體-配體相互作用、研究細胞水平和回路水平的信號傳遞、以及研究整體行為水平的功能調(diào)控，本次成果有望為阿片系統(tǒng)的研究帶來革命性進展。
它讓人們朝著更好地理解內(nèi)源性阿片系統(tǒng)邁出了重要一步，為阿片肽系統(tǒng)的研究提供了富有價值的新工具。
對于當(dāng)前的神經(jīng)科學(xué)“工具箱”來說，內(nèi)源性阿片類物質(zhì)和合成阿片類物質(zhì)的探針是一個很好的補充，能為阿片類信號傳導(dǎo)帶來更好的時空采樣。
這既能推動神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，也有望為疼痛管理、成癮治療等臨床應(yīng)用開辟新前景。
（來源：Nature Neuroscience）
從阿片類神經(jīng)肽的“地位”說起據(jù)介紹，在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，阿片類神經(jīng)肽系統(tǒng)占據(jù)著核心地位。
而作為一類關(guān)鍵的神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，阿片肽在調(diào)控疼痛感知、獎賞行為、情緒反應(yīng)、以及成癮過程等多個生理過程和病理過程中，扮演著不可或缺的角色。
然而，長期以來對于內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)的深入研究，一直受到技術(shù)手段的限制。
免疫組化、放射性配體結(jié)合實驗等傳統(tǒng)研究方法，雖然能夠提供靜態(tài)的阿片肽分布信息，但是難以捕捉到阿片肽在活體神經(jīng)系統(tǒng)中的動態(tài)釋放過程和精細的時空分布模式。
特別是在探究特定神經(jīng)回路中的阿片肽功能，以及探究在復(fù)雜行為狀態(tài)下阿片肽釋放的動態(tài)變化時，現(xiàn)有技術(shù)往往顯得力不從心。
為了突破上述瓶頸，董春陽和合作者基于基因編碼開發(fā)出這種阿片受體熒光探針策略。
此前，董春陽的博士導(dǎo)師曾開發(fā)一種鈣離子探針 GCaMP3，該探針能在多物種體內(nèi)使用熒光來解析腦神經(jīng)活性，為高時空分辨率檢測神經(jīng)活性做出了重要貢獻。
也為鈣離子探針的優(yōu)化奠定了一定基礎(chǔ)，目前 GCaMP 系列鈣離子探針已在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
董春陽導(dǎo)師的上述成果，為本次開發(fā)新型神經(jīng)遞質(zhì)探針奠定了基礎(chǔ)。
在導(dǎo)師的指導(dǎo)之下，這幾年來董春陽曾參與研究紅移的多巴胺探針，并開發(fā)出兩種 5-羥色胺探針、以及其他多種神經(jīng)肽探針。
同時，董春陽還與北京大學(xué)李毓龍教授團隊合作發(fā)表了關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)探針開發(fā)和應(yīng)用的綜述論文。這些經(jīng)驗為他探索更加復(fù)雜的阿片肽探針提供了一定洞見。
在此基礎(chǔ)之上，董春陽意識到與之前開發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)探針相比，阿片肽探針的開發(fā)面臨著更大的挑戰(zhàn)。
阿片肽系統(tǒng)非常復(fù)雜，其包括多種內(nèi)源性阿片肽和多個受體亞型，這讓開發(fā)具有高度特異性的探針變得尤為困難。
而且與其他探針不同的是，阿片肽探針的開發(fā)沒有現(xiàn)成的公式可循。這意味著每一個探針變體都需要單獨設(shè)計和逐一驗證，這大大增加了工作量和復(fù)雜性。
比如，需要在保持受體功能的同時，找到最佳的熒光蛋白插入位點和連接序列。期間，涉及到大量的分子生物學(xué)工作，包括設(shè)計、構(gòu)建和篩選數(shù)百個不同的變體。
而在體外表征階段，則需要仔細評估每個探針變體對不同阿片肽和受體亞型的反應(yīng)。包括詳細測定探針的動態(tài)范圍、靈敏度、選擇性以及反應(yīng)動力學(xué)。
通過大量的體外表征實驗，董春陽等人篩選出了動態(tài)范圍較大、靈敏度較高、特異性較高的變體。
隨后，他們圍繞探針的特異性開展驗證工作，并在強啡肽敲除小鼠和野生型小鼠之間，利用光遺傳刺激 BLA-NAc 回路的實驗，證明了 κLight 對于強啡肽的特異性。
這不僅能確保探針在復(fù)雜神經(jīng)環(huán)境中仍能保持特異性和靈敏度，也確保了用戶在生理條件下使用探針的可靠性。
（來源：Nature Neuroscience）
無數(shù)次的重復(fù)、失敗、優(yōu)化、再重復(fù)董春陽表示，本次研究的目標(biāo)之一，是希望在體外和離體腦片中，全面表征這些新型探針的藥理學(xué)特性。
包括測定探針對于不同內(nèi)源性阿片肽和合成阿片肽的親和力、選擇性和動力學(xué)特征。
在與傳統(tǒng)放射性配體結(jié)合實驗加以對比之后，他們希望驗證這些探針能否準確地反映阿片肽與受體的相互作用。
同時，還需要評估探針的表達，是否會影響內(nèi)源性阿片受體的正常功能，以便確保其在生理條件下的應(yīng)用價值。
本次研究的目標(biāo)之二，是希望利用這些探針探索阿片肽在腦組織中的擴散特性。
此前，人們認為阿片肽主要通過體積傳遞的方式來發(fā)揮作用。但是，對于具體的擴散范圍和速率，始終缺乏直接的證據(jù)。
為此，該課題組設(shè)計了精巧的光解實驗，通過釋放光敏性阿片肽前體，來同時監(jiān)測熒光信號的變化，借此首次實現(xiàn)了對于阿片肽擴散過程的實時觀察和定量分析。
通過這一實驗，他們不僅揭示了阿片肽的擴散常數(shù)，還為理解阿片肽信號的空間范圍提供了重要依據(jù)。
本次研究的目標(biāo)之三，是希望確定能夠觸發(fā)內(nèi)源性阿片肽釋放的最佳電刺激參數(shù)，這對于在體內(nèi)研究阿片肽的功能至關(guān)重要。
通過在腦片中系統(tǒng)地調(diào)整刺激強度、刺激頻率和刺激持續(xù)時間，以及監(jiān)測熒光探針的響應(yīng)，該團隊希望找出最有效的刺激模式，從而為電生理實驗和光遺傳學(xué)實驗奠定一定基礎(chǔ)。
在活體動物實驗中，他們將這些熒光探針與光遺傳學(xué)技術(shù)加以結(jié)合，借此探索特定神經(jīng)回路中的阿片肽釋放動態(tài)。
例如，通過在伏隔核表達 κLight 探針，以及在杏仁核表達光敏性離子通道，就能精確地控制特定投射的激活，并能實時觀察由此誘發(fā)的內(nèi)源性強啡肽釋放。
這種做法的好處在于：不僅能提供前所未有的時間和空間分辨率，還能揭示阿片肽釋放的空間特異性。
此外，課題組還開展了如下探索：即在復(fù)雜行為狀態(tài)之下比如在恐懼條件化過程和獎賞學(xué)習(xí)過程中，探索阿片肽釋放會發(fā)生的動態(tài)變化。
通過在自由活動的動物中開展光纖光度測量，董春陽等人用探針捕捉到了與特定行為相關(guān)的阿片肽信號變化。
他至今記得首次在活體小鼠中成功捕捉到內(nèi)源性阿片肽釋放的瞬間。其表示：“我們花了幾年時間來優(yōu)化探針，終于在體外確認了一個預(yù)期能在活體中成功應(yīng)用的變體?！?/span>
詳細來說，他們將 κLight 質(zhì)粒包裹到腺相關(guān)病毒之中，在熟悉小鼠腦區(qū)坐標(biāo)之后，開始進行顱內(nèi)病毒注射，然后等待探針在小鼠腦子里表達。
“無數(shù)次的重復(fù)、失敗、優(yōu)化、再重復(fù)，當(dāng)在光線記錄的電腦屏幕上看到了 κLight 探針隨著恐懼條件刺激的進行，一個又一個明亮的信號峰開始出現(xiàn)，讓人確實有點感動。”董春陽說。
但是，科學(xué)的理性很快把他拽回來，他必須證明自己看到的是 κLight 檢測到強啡肽的信號而不是其他假象。
通過多只小鼠證明上述現(xiàn)象的可重復(fù)性之后，課題組通過設(shè)計不同實驗，尤其是使用強啡肽敲除小鼠的光遺傳實驗，證明在沒有強啡肽且刺激相同的情況下，探針不會出現(xiàn)信號，借此證明了探針的準確性和特異性。
最后，當(dāng)各個實驗都指向一個特異性強且信噪比高的結(jié)果時，大家懸著的心才終于放下。
（來源：Nature Neuroscience）最終，相關(guān)論文以《利用基因編碼生物探針揭示阿片類神經(jīng)肽動態(tài)》（Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors）為題發(fā)在 Nature Neuroscience（IF 21.2）。
圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature Neuroscience）董春陽和美國華盛頓大學(xué)拉賈拉姆·高里尚卡爾 （Raajaram Gowrishankar）是共同一作。
美國華盛頓大學(xué)邁克爾·布魯查斯（Michael R. Bruchas）教授、美國加州大學(xué)圣地亞哥分校馬修·班哈特（Matthew R. Banghart）教授、以及馬克斯普朗克佛羅里達州神經(jīng)科學(xué)研究所田琳教授擔(dān)任共同通訊作者。
憑借這一成果，董春陽獲得了美國國立衛(wèi)生院托妮·希彭伯格 （Toni Shippenberg）青年研究者獎。
在應(yīng)用前景上：
其一，能用于基礎(chǔ)神經(jīng)科學(xué)研究。
本次打造的阿片受體熒光探針，將讓人們更精確地觀察和測量阿片肽在神經(jīng)系統(tǒng)中的動態(tài)變化，從而幫助揭示阿片系統(tǒng)在各種神經(jīng)過程中的具體作用，比如揭示學(xué)習(xí)作用、記憶作用、情緒調(diào)節(jié)作用等。
其二，能用于疼痛研究。
在疼痛調(diào)節(jié)中，阿片系統(tǒng)扮演著關(guān)鍵角色。因此，本次探針有望用于研究急性疼痛狀態(tài)下和慢性疼痛狀態(tài)下的阿片肽釋放模式，從而助力于開發(fā)更加有效的疼痛管理策略。
其三，能用于成癮機制研究。
通過實時監(jiān)測阿片肽在獎賞回路中的活動，或能更好地理解藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，從而為開發(fā)新型治療方法提供線索。
其四，能用于藥物開發(fā)和藥物篩選。
即本次探針或可被用于高通量篩選，以幫助識別新型阿片受體調(diào)節(jié)劑，從而助力開發(fā)更安全、更有效的止痛藥物。
其五，能用于情緒障礙研究。
鑒于阿片系統(tǒng)與情緒調(diào)節(jié)的密切關(guān)系，本次探針有望被用于研究抑郁癥、焦慮癥等情緒障礙的神經(jīng)機制。
其六，能用于神經(jīng)影像學(xué)應(yīng)用。
當(dāng)把這些探針加以改造，則有望用于非侵入性腦成像技術(shù)，進而用于觀察人類大腦的阿片系統(tǒng)活動。
其七，能用于開發(fā)神經(jīng)調(diào)控技術(shù)。
結(jié)合光遺傳學(xué)技術(shù)或化學(xué)遺傳學(xué)技術(shù)，這些探針有望幫助開發(fā)更加精確的神經(jīng)調(diào)控技術(shù)，以用于治療與阿片系統(tǒng)相關(guān)的疾病。
其八，能用于行為神經(jīng)科學(xué)研究。
即用于研究阿片系統(tǒng)在復(fù)雜社會行為、決策制定等高級認知功能中的作用。
其九，能用于預(yù)防藥物濫用。
通過深入了解阿片系統(tǒng)的功能，有助于開發(fā)更有效的藥物濫用預(yù)防策略和教育方法。
其十，能用于個體化醫(yī)療。
通過在動物模型中研究不同個體阿片系統(tǒng)的反應(yīng)差異，或能為個體化疼痛治療和成癮管理提供理論基礎(chǔ)。
概括來說，這些潛在應(yīng)用不僅有望推動神經(jīng)科學(xué)基礎(chǔ)研究的發(fā)展，還可能會對臨床醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)和公共衛(wèi)生政策產(chǎn)生重大影響。
當(dāng)然，從基礎(chǔ)研究到實際應(yīng)用，還需要多年的研究和驗證。
而在未來：
首先，將提高現(xiàn)有探針的性能。
即改善已有神經(jīng)肽探針的特異性、靈敏度、動態(tài)范圍和動力學(xué)特性。
這可能會涉及到更復(fù)雜的蛋白質(zhì)工程策略，比如 AI 輔助的定向進化、結(jié)構(gòu)生物學(xué)指導(dǎo)的理性設(shè)計等。
其次，將開發(fā)針對更多神經(jīng)肽的熒光探針。
即把已有經(jīng)驗擴展到其他的神經(jīng)肽系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)之中。
再次，將已有探針與其他成像技術(shù)相結(jié)合。
例如，將神經(jīng)肽探針與超分辨率顯微技術(shù)或微型化的雙光子顯微鏡結(jié)合，有望讓人們在亞細胞水平、或在自由活動動物中，觀察神經(jīng)肽的釋放動態(tài)。
同時，在多色成像技術(shù)的幫助之下，人們或能同時觀察多種神經(jīng)肽或神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)，從而能夠揭示它們之間的相互作用。
最后，這些探針的應(yīng)用不僅限于基礎(chǔ)研究，還有潛力延伸到藥物開發(fā)領(lǐng)域，即用于開發(fā)高通量篩選平臺，從而助力發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)精神藥物。
對于神經(jīng)肽探針來說，它也將繼續(xù)推動神經(jīng)科學(xué)研究朝著更高時空分辨率、更廣泛分子多樣性、以及更復(fù)雜行為的范式方向發(fā)展，為理解大腦功能和開發(fā)新型治療策略提供支持。
參考資料：
1.Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y.et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1
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