高效液相色譜儀的原理

　　特點

　　1.高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。

　　2.高速：流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h 。

　　3. 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。

　　4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。

　　5.適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點，但是受技術(shù)條件的限制，沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于400 以上）的有機物（這些物質(zhì)幾乎占有機物總數(shù)的 75% ～ 80% ）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。

　　高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進行。

高效液相色譜法的主要類型及其分離原理

　　根據(jù)分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：

　　1 ．液 — 液分配色譜法（Liquid-liquid PartitionChromatography）及化學鍵合相色譜（Chemically Bonded PhaseChromatography）流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于下式：式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度；cm--溶質(zhì)在流動相中的濃度；Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

　　a. 正相液 — 液分配色譜法（Normal Phase liquidChromatography）： 流動相的極性小于固定液的極性。

　　b. 反相液 — 液分配色譜法（Reverse Phase liquidChromatography）： 流動相的極性大于固定液的極性。

　　c. 液 —液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發(fā)展的化學鍵合固定相（見后），可克服上述缺點?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70~80%）。

　　2 ．液 — 固色譜法

　　流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質(zhì)分子（X） 和溶劑分子（S）對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm + nSa ====== Xa + nSm

　　式中：Xm--流動相中的溶質(zhì)分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質(zhì)分子；Sm--流動相中的溶劑分子。

　　當吸附競爭反應(yīng)達平衡時：K=［Xa］［Sm］/［Xm］［Sa］式中：K為吸附平衡常數(shù)。

3 ．離子交換色譜法（Ion-exchange Chromatography）

　　IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

　　以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：

　　X-（溶劑中） + （樹脂-R4N+Cl-）=== （樹脂-R4N+ X-） + Cl-（溶劑中）

　　當交換達平衡時：

　　KX=［-R4N+ X-］［ Cl-］/［-R4N+Cl-］［ X-］

　　分配系數(shù)為：

　　DX=［-R4N+ X-］/［X-］= KX ［-R4N+Cl-］/［Cl-］

　　凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。

　　4 ．離子對色譜法（Ion Pair Chromatography）

　　離子對色譜法是將一種 （ 或多種 ）與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 （ 稱為對離子或反離子 ）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式表示：X+水相 + Y-水相 === X+Y-有機相

　　式中：X+水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X+Y---形成的離子對化合物。