電泳技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
一、電泳分析儀
電泳分析儀可分為兩大類(lèi):臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)類(lèi),如全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀、全自動(dòng)醋纖膜電泳儀、全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀和全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀;科研為主兼做臨床樣本類(lèi),如雙向電泳及雙向電泳2液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳2質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管芯片電泳、DNA測(cè)序系統(tǒng)。
1. 全自動(dòng)熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng)電泳儀:具有熒光/可見(jiàn)光雙系統(tǒng),在使用熒光試劑項(xiàng)目如肌酸激酶(CK) 、乳酸脫氫酶(LD)同工酶時(shí)為全自動(dòng)。只需將樣品、試劑、瓊脂糖凝膠電泳膠片放好后,操作人員可離機(jī)完成試驗(yàn)并得到結(jié)果,此為全自動(dòng)電泳儀。但是使用可見(jiàn)光項(xiàng)目如蛋白電泳,中途人員需返回,將電泳膠片由電泳槽放入染色系統(tǒng)中才可完成試驗(yàn)。而最大優(yōu)點(diǎn)是熒光系統(tǒng)全自動(dòng)且靈敏度高,準(zhǔn)確度高并且采用高壓、低溫系統(tǒng),只需要20 min即可完成電泳分析,速度非??臁?/P>
2. 全自動(dòng)醋纖膜電泳儀:為可見(jiàn)光單系統(tǒng),使用醋纖膜電泳片。自動(dòng)化程度高,只需將樣品、試劑、電泳片放好,人員可離機(jī)完成試驗(yàn)得到結(jié)果。但是因?yàn)槭褂么桌w膜致使靈敏度低,無(wú)法分析尿蛋白/腦脊液蛋白,對(duì)同工酶分析效果也不理想,多半實(shí)驗(yàn)室只用于血清蛋白電泳分析。
3. 全自動(dòng)瓊脂糖電泳儀:為可見(jiàn)光單系統(tǒng),使用瓊脂糖凝膠電泳膠片。優(yōu)點(diǎn)為靈敏度高,可使用于低濃度蛋白檢驗(yàn),如尿蛋白及腦脊液蛋白。而同工酶的分離效果也相當(dāng)不錯(cuò)。但缺點(diǎn)為自動(dòng)化程度較差,當(dāng)電泳結(jié)束和染色脫色完成后,工作人員必須將電泳片由機(jī)器中取出,對(duì)實(shí)驗(yàn)室較為麻煩。但是因?yàn)檫@類(lèi)儀器所能做項(xiàng)目比較多,且靈敏度較高仍為許多實(shí)驗(yàn)室所接受。
4. 全自動(dòng)電泳分析系統(tǒng):集上述儀器的優(yōu)點(diǎn),自動(dòng)點(diǎn)樣、電泳、呈色(或染色、脫色) 、烘干。可用各種電泳片,包括瓊脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等,采用可見(jiàn)光及熒光呈色雙系統(tǒng),是一種較理想的電泳儀。
5. 雙向電泳及雙向電泳2液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用:雙向電泳第一向?yàn)榈入娋劢?,第二向?yàn)樘荻仁榛撬徕c( SDS)電泳。樣品經(jīng)過(guò)電荷與質(zhì)量?jī)纱畏蛛x后可得到分子的等電點(diǎn)、分子量等信息,這是目前所有電泳技術(shù)中分辨率最高,信息量最多的技術(shù),已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。自1975年,O′Farrel等建立這種技術(shù)后,已有許多改進(jìn),使得這一技術(shù)日趨完善。ISO2DALT系統(tǒng)的第一向是用管狀凝膠,雖然分辨率高、上樣量大、耐高鹽等優(yōu)點(diǎn),但有陰極漂移而丟失堿性蛋白、載體兩性電解質(zhì)pH梯度不穩(wěn)定、受電場(chǎng)和時(shí)間影響而重復(fù)性不好等缺點(diǎn)。20世紀(jì)80年代后期, Gorg等將固相pH梯度等電聚焦技術(shù)用作雙向電泳的第一向,稱(chēng)為IPG2DALT。固相pH梯度等電聚焦沒(méi)有陰極漂移, pH梯度穩(wěn)定,分辨率高,重復(fù)性好,是目前流行的雙向電泳技術(shù)。與傳統(tǒng)的單向電泳方法最多只能分析100種蛋白質(zhì)樣品相比,雙向電泳最多可分析5 000 ~ 10 000個(gè)蛋白點(diǎn)的圖譜。雙向電泳在分離蛋白混合樣品,比較差異方面有不可替代的作用。當(dāng)發(fā)現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)時(shí),將其切下再用液相色譜分離,與質(zhì)譜聯(lián)用,最后可鑒定新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組分。
6. 高效毛細(xì)管電泳及高效毛細(xì)管電泳2質(zhì)譜聯(lián)用:高效毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為推動(dòng)力,依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。利用毛細(xì)管代替平板凝膠,分離效率得以提高。高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍從小分子、無(wú)機(jī)離子到生物大分子,甚至整個(gè)細(xì)胞,從帶電粒子到中性分子都可用高效毛細(xì)管電泳方法進(jìn)行分析。目前,毛細(xì)管與質(zhì)譜的接口難題已經(jīng)解決,人們能利用毛細(xì)管電泳的高效分離能力與質(zhì)譜的鑒定技術(shù)聯(lián)用發(fā)揮其特殊功能,發(fā)現(xiàn)未知的化合物。尤其是陣列毛細(xì)管電泳儀已經(jīng)問(wèn)世,這將克服目前大多數(shù)商品化毛細(xì)管電泳儀只能進(jìn)行單根毛細(xì)管電泳的缺陷,這種高通量的新方法將會(huì)給后基因組時(shí)代的基因分析帶來(lái)革命性的變化。
7. 毛細(xì)管電泳芯片:利用毛細(xì)管電泳芯片可以進(jìn)行DNA長(zhǎng)度、序列和基因分型等分析,在臨床檢測(cè),尤其在遺傳病的診斷中具有重要意義。現(xiàn)在分離DNA,是利用芯片分離熒光標(biāo)記的寡核苷酸,整個(gè)分離過(guò)程在45 s之內(nèi),而芯片的長(zhǎng)度僅為318 cm。因?yàn)槠淇沙休d高電壓(2 300 V / cm)并具有較小的樣品體積,故有利于得到較好的分離效果。而用傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳分離技術(shù)分離DNA樣品,通常需要10~30 min,電壓也只能加到500 V / cm。另外有人制作的用于高速DNA分離的芯片,有效長(zhǎng)度僅為315 cm,分離從70~1 000bp的DNA 片斷,時(shí)間在120 s以?xún)?nèi)。目前,高速、高通量的毛細(xì)管電泳芯片已經(jīng)發(fā)展得比較完善。2002年筆者曾在瑞典召開(kāi)的第十五屆國(guó)際微量分離與分析會(huì)議上見(jiàn)到Caliper公司設(shè)計(jì)的DNA電泳芯片,即在一個(gè)光盤(pán)大小的芯片上有96個(gè)毛細(xì)管電泳陣列,分別與96個(gè)樣品池相連,呈輻射狀,并采用一個(gè)旋轉(zhuǎn)的共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。此系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)96個(gè)不同的樣品進(jìn)行分離,分離檢測(cè)過(guò)程在8 min以?xún)?nèi)。
8. DNA測(cè)序系統(tǒng):該系統(tǒng)利用凝膠毛細(xì)管的原理,將多道毛細(xì)管陣列設(shè)計(jì),用4種不同的熒光染色標(biāo)記4種核苷酸,在模板上合成DNA單鏈,然后在DNA外切酶的作用下進(jìn)行堿基的連續(xù)水解和釋放,用激光識(shí)別和記錄釋放的堿基??捎糜贒NA序列測(cè)定,雜合子自動(dòng)檢測(cè),點(diǎn)突變分析,等位基因鑒定, SNP篩查,雜合性缺失檢測(cè),AFLP指紋圖譜,微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定性分析,基因表達(dá),測(cè)序質(zhì)量評(píng)估,序列比較等。20世紀(jì)90年代中期,測(cè)序儀重大改進(jìn),集束化的毛細(xì)管電泳代替凝膠電泳。2001年完成人類(lèi)基因組框架圖提前完成得益于多通道、集束化的毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)的出現(xiàn)。目前,在我國(guó)已有少數(shù)醫(yī)院開(kāi)始采用8 通道的DNA測(cè)序,系統(tǒng)開(kāi)展用拉米夫定治療乙型肝炎病毒(HBV)的YMDD突變檢測(cè)。
評(píng)論