熒光顯微鏡檢測原理及方法
用于熒光顯微鏡的主要濾板如表1。
表1 熒光顯微鏡常用濾板型號和透光特點
基本色調(diào) | 相應(yīng)名稱 | 2mm厚透光范圍(峰值)nm | |||
上海電器元件廠 | 德國(Schott) | 蘇聯(lián) | 日本 | ||
黑紫 | ZWB-1 | UG-1 | yΦC-2 | DV-1 | 300~400(365) |
黑紫 | ZWB-2 | UG-5 | yΦC-1 | - | 280~240(360) |
靛藍(lán) | ZB-2 | BG-1 | ΦC-1 | BG-1 | 300~500(380) |
靛藍(lán) | ZB-3 | BG-3 | CC-4 | BG-3 | 260~520(400) |
靛藍(lán) | QB-24 | BG-12 | CC-8 | BG-12 | 310~570(420) |
淡藍(lán) | QB-10 | BG-38 | C3C-5 | - | 310~720(460) |
- | QB-12 | - | -8 | - | - |
- | - | - | -11 | - | - |
橙黃 | CB-3 | OG-1(K530) | OC-11 | OG-1 | 530以上 |
橙黃 | JB-8 | OG-4(K510) | ЖC-18 | FY-5 | 510以上 |
綠橙 | JB-7 | GG-11(K490) | ЖC-17 | FY-3 | 480以上 |
- | - | - | - | FY-4 | - |
淡綠 | JB-4 | GG-3(K430) | жC-11 | US-10 | 420以上 |
紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3,外加BG-38。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。
最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。
近年開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對性強,波長適當(dāng),因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。
激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?;疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。
2.壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過,提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng),常用以下3種壓制濾板:
紫外光壓制濾板:可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6 K460。
紫藍(lán)光壓制濾板:能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅),能與BG-12組合。通常用OG-4 K510或OG-1 K530。
紫外紫光壓制濾板:能通過460nm以上波長的熒光(藍(lán)到紅),可與BG-3組合,常用OG-11 K470AK 490,K510。
(三)反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的,因為鋁對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,反射達(dá)90%以上,而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。
(四)聚光鏡
專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。
1.明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器,它具有聚光力強,使用方便,特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。
2.暗視野聚光器
暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進(jìn)入物鏡,因而除散射光外,激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,可以使用薄的激發(fā)濾板,增強激發(fā)光的強度,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發(fā)時,可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強了熒光圖像的亮度和反襯度,提高了圖像的質(zhì)量,觀察舒適,可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。
3.相差熒光聚光器
相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察,既能看到熒光圖像,又能看到相差圖像,有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。
(五)物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用,但最好用消色差的物鏡,因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,而與其放大倍數(shù)成反比,所以為了提高熒光圖像的亮度,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強的標(biāo)本,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,配合以盡可能低的目鏡(4×,5×,6.3×等)。
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