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熒光顯微鏡檢測(cè)原理及方法

作者: 時(shí)間:2013-03-05 來源:網(wǎng)絡(luò) 收藏


(六)目鏡

中多用低倍目鏡,如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡,因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上,但目前研究型多用雙筒目鏡,觀察很方便。

(七)落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后,波長短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射,當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí),則垂直射向物鏡,經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,使標(biāo)本受到激發(fā),這時(shí)物鏡直接起的作用。同時(shí),濾長長的部分(綠、黃、紅等),對(duì)濾鏡是可透的,因此,不向物鏡方向反射,濾鏡起了激發(fā)濾板作用,由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū),可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察,熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外,更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型多采用落射光裝置,稱之為落射熒光顯微鏡。

二、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

(一)載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔,厚度均勻,無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右,光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光,也可用干涉蓋玻片,這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片,它可以使熒光順利通過,而反射激發(fā)光,這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

(三)標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋,影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油,必須無自發(fā)熒光,無色透明,熒光的亮度在pH8.5~9.5時(shí)較亮,不易很快褪去 。所以,常用甘油和0.5mol/L pH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須使用鏡油,最好使用特制的無熒光鏡油,也可用上述甘油代替,液體石蠟也可用,只是折光率較低,對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。
(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5~15min,待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛完全適應(yīng)暗室,再開始觀察標(biāo)本。
(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。
(4)檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5
min后,熒光也明顯減弱;所以,最多不得超過2~3h。
(5)熒光顯微鏡光源壽命有限 ,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)
省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。
(6)標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā)。
(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般分為四級(jí),即“一”—無或可見微弱熒光?!?”—僅能見明確可見的熒光?!?+”—可見有明亮的熒光。“+++”—可見耀眼的熒光。

四、熒光圖像的記錄方法

熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,一是具有形態(tài)學(xué)特征,二是具有熒光的顏色和亮度,在判斷結(jié)果時(shí),必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察,基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果,如用細(xì)胞分光光度計(jì),圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果,也必須結(jié)合主觀的判斷。

熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要,由于熒光很易褪色減弱,要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大,如FITC的標(biāo)記物,在紫外光下照射30s,熒光亮度降低50%。所以,曝光速度太慢,就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。(end)

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