90后科研伉儷發(fā)現(xiàn)ASA6新抗體，可減少動(dòng)脈硬化斑塊形成，有望用于動(dòng)脈粥樣硬化靶向診斷和治療

在青島大學(xué)讀碩士期間，張立煒完成了研究的主要部分，當(dāng)時(shí)王語是張立煒隔壁課題組的師姐，也因?yàn)楹献鬟@次研究相識(shí)相知。目前，兩人已經(jīng)領(lǐng)證成家，且也都在德國讀博。
9 月 28 日，相關(guān)論文以《用于動(dòng)脈粥樣硬化的 MR/NIR-II 成像和抗動(dòng)脈粥樣硬化治療的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊靶向單鏈抗體》（An atherosclerotic plaque-targeted single-chain antibody for MR/NIR-II imaging of atherosclerosis and anti-atherosclerosis therapy）為題發(fā)表在 Journal of Nanobiotechnology 上，張立煒擔(dān)任第一作者，王語是第六作者，在薛升教授的指導(dǎo)下，張立煒等人順利完成了這一研究。


今年 7 月，《中國心血管健康與疾病報(bào)告 2020》發(fā)布，報(bào)告顯示中國心血管病患病率處于持續(xù)上升態(tài)勢，患病人數(shù)約 3.3 億，其中冠心患者約 1139 萬。冠心病本屬于 “老年病”，但發(fā)病年齡也在逐漸降低。更令人擔(dān)心的是，報(bào)告顯示“心血管病致死”居中國城鄉(xiāng)居民總死亡原因首位。這說明，年輕人對(duì) “心” 要 “上心”。


而張立煒發(fā)現(xiàn)的 ASA6，能和氧化的低密度脂蛋白以及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)合，并能抑制巨噬細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白的攝取，從而減少巨噬細(xì)胞的凋亡。

在臨床工作中，張立煒發(fā)現(xiàn)缺血性心肌病并不完全由于冠脈血管性病變導(dǎo)致，常常會(huì)有其他原因?qū)е屡c冠心病相似的臨床癥狀。同時(shí)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病也存在個(gè)體差異性，但絕大部分缺血性心肌病患者均需進(jìn)行冠脈造影術(shù)。

雖然冠脈造影術(shù)屬于微創(chuàng)手術(shù)，但從臨床角度觀察，患者由于各種原因也對(duì)此手術(shù)存在抵觸心理，同時(shí)也需要承擔(dān)價(jià)格不菲的造影費(fèi)用。因此，從臨床角度出發(fā)，如何尋找一個(gè)患者接受度高價(jià)格又相對(duì)實(shí)惠的診斷方法，成為他想進(jìn)行此項(xiàng)研究開發(fā)的初衷。


一般來講，缺血性心肌病患者需要首先進(jìn)行血脂血糖心臟 B 超等常規(guī)檢查，進(jìn)而輔助臨床醫(yī)生來判斷是否對(duì)患者進(jìn)行冠脈造影術(shù)。但通過常規(guī)的臨床檢查，臨床醫(yī)生依靠經(jīng)驗(yàn)很難確切地了解冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)的堵塞程度，因此一部分患者在做完冠脈造影術(shù)后發(fā)現(xiàn)并不是血管源性缺血性心肌病。

另外，通常情況下，患者先是接受冠脈造影術(shù)，此后根據(jù)個(gè)人情況進(jìn)行冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)（PCI 術(shù)），但也存在一些相對(duì)特殊的情況，如患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化鈣化情況過于嚴(yán)重，并不適于進(jìn)行 PCI 術(shù)。這些情況依靠臨床經(jīng)驗(yàn)很大程度上無法有效避免。

另外值得注意的是，動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)際上是一種全身性的疾病，只是冠狀動(dòng)脈位于心臟這一關(guān)鍵位置，所以冠心病患者的臨床癥狀較為明顯。同樣，動(dòng)脈粥樣硬化也是腦卒中的病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一。

總結(jié)這些因素，是否能夠開發(fā)一個(gè)能一次性診斷全身動(dòng)脈粥樣硬化、易于實(shí)現(xiàn)、并且患者接受度高的方法呢？同時(shí)，是否可以開發(fā)一種即可用于臨床診斷、又可用于臨床治療的方法呢？帶著這些初衷，張立煒開發(fā)了全新的基于抗體靶向的診斷和治療方案。

張立煒介紹，該項(xiàng)技術(shù)首先從病理生理學(xué)上驗(yàn)證了對(duì)于自身脂代謝異常，人體自身免疫系統(tǒng)仍然可以產(chǎn)生有效的抗體，但這部分抗體的自身產(chǎn)生量無法有效抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。

不過，這部分抗體的編碼序列被保存在淋巴細(xì)胞的基因序列當(dāng)中。因此，可以利用這些被保存的基因序列在體外進(jìn)行抗體重組、大規(guī)模生產(chǎn)和效果驗(yàn)證等一系列操作。同時(shí)，該項(xiàng)研究也是 2018 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)——噬菌體展示技術(shù)的最新應(yīng)用。

有趣的是，張立煒發(fā)現(xiàn)他篩選出的抗體，可以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化血管中的細(xì)胞產(chǎn)生 “線粒體阻滯” 效應(yīng)，這是該研究最有趣且意外的發(fā)現(xiàn)。目前尚不清楚該效應(yīng)確切的觸發(fā)機(jī)制、以及該效應(yīng)所產(chǎn)生的血管保護(hù)作用的確切機(jī)制。但這為未來的研究提供了很好的方向和理論基礎(chǔ)。

研究中，張立煒先從臨床中獲得 55 例通過冠脈造影術(shù)明確診斷為血管動(dòng)脈粥樣硬化患者的外周血，并從中分離了淋巴細(xì)胞。此后對(duì)這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)的 Total RNA 提取并此過程中評(píng)估了 RNA 質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)反轉(zhuǎn)并池化，最終獲得 55 例患者淋巴細(xì)胞 cDNA 文庫。

值得注意的是，人體產(chǎn)生的抗體在基因編碼層面存在保守序列，類似不同抗體序列均存在 “這是抗體序列” 的標(biāo)簽。因此，在下一步中張立煒利用這些標(biāo)簽作為 PCR 體外擴(kuò)增的引物，將 cDNA 文庫中抗體編碼序列全部一次性擴(kuò)增出來。最后通過 SOE-PCR 將編碼抗體長鏈和短鏈的基因序列拼接起來，形成人源抗體基因序列文庫。

接下來他將該抗體文庫插入質(zhì)粒當(dāng)中并導(dǎo)入大腸桿菌中，使得所有大腸桿菌成為下一步噬菌體展示的“食物工廠”。然后使用 M13 型噬菌體對(duì)這些大腸桿菌文庫進(jìn)行侵染。

噬菌體進(jìn)入大腸桿菌后，對(duì)利用大腸桿菌體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)重組產(chǎn)生新的噬菌體，但此過程中噬菌體會(huì)把他導(dǎo)入的抗體序列庫翻譯，并表達(dá)在噬菌體的蛋白 “帽子” 上。

接下來，他從臨床上收集了若干動(dòng)脈粥樣硬化的人體血管樣本，并利用這些新產(chǎn)生的噬菌體對(duì)其進(jìn)行了噬菌體展示篩選，最終淘選出大約 106 個(gè)陽性噬菌體，這其中每個(gè)噬菌體均存在一種特異性靶向動(dòng)脈粥樣硬化板塊的陽性抗體。隨后，張立煒從中挑選了一種親和力最高的抗體并命名為 ASA6。

緊接著，他將含有 ASA6 的噬菌體再次導(dǎo)入相應(yīng)的大腸桿菌，提取質(zhì)粒并導(dǎo)入另外一種大腸桿菌，使其成為抗體大規(guī)模組裝的體外 “工廠”。

最終經(jīng)過悉心繁殖和培養(yǎng)，張立煒從中提取并獲得了足量的 ASA6 抗體。并在體外通過蛋白印跡和免疫熒光等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證了 ASA6 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的高親和力和特異性。

據(jù)他介紹，在蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李楨教授的幫助下，他和團(tuán)隊(duì)合成了含有金屬釓和金屬釹的納米顆粒，通過 EDC-NHS 反應(yīng)將納米顆粒與抗體進(jìn)行了偶聯(lián)，并通過透射電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀等方法對(duì)偶聯(lián)物進(jìn)行了物質(zhì)形態(tài)的表征。

同時(shí)，他也對(duì)該偶聯(lián)物進(jìn)行了生物相容度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示該偶聯(lián)物并不會(huì)損傷實(shí)驗(yàn)鼠的各個(gè)器官，偶聯(lián)物通過尿液有效排出體外。

此后，在核磁共振（NMR）和近紅外光（NIR）上，張立煒使用該偶聯(lián)物對(duì)高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠進(jìn)行了靶向斑塊的顯影。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種不同模態(tài)下，該偶聯(lián)物均可對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有有效的示蹤效果。

同時(shí)，他將 ASA6 注射到高脂飲食的 ApoE 基因敲除鼠中，觀察其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制效果，結(jié)果顯示 ASA6 可大大抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生。他也對(duì)這部分小鼠血管進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，并明確了 ASA6 可誘導(dǎo)血管細(xì)胞產(chǎn)生 “線粒體阻滯” 效應(yīng)，進(jìn)而抑制了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展。總之，這些數(shù)據(jù)證明了 ASA6 抗體在和無創(chuàng)成像中的潛力。

談及相關(guān)應(yīng)用，張立煒表示，ASA6 抗體是一種人源性抗體。以往的抗體篩選，一般使用小鼠作為抗體篩選對(duì)象，但其篩選出的抗體為鼠源性抗體，對(duì)鼠源性抗體進(jìn)行人源化處理，是一個(gè)繁雜且耗時(shí)耗力的工程。

而該研究直接獲取人源性抗體，避免了后期人源化的麻煩，因此可直接進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)。但仍面臨抗體組裝的問題。

其次，ASA6- 納米顆粒偶聯(lián)物有望實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)全身所有血管動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的探測，高效且在大規(guī)模生產(chǎn)后大大降低臨床診斷費(fèi)用以及獲得更為良好的患者接受度。

最后，本研究所發(fā)現(xiàn)的 “線粒體阻滯” 效應(yīng)可為未來針對(duì)血脂代謝異常提供良好的病理生理學(xué)基礎(chǔ)和研究方向。未來對(duì)該效應(yīng)進(jìn)行細(xì)致研究后，有望開發(fā)出針對(duì)血脂代謝異常以及動(dòng)脈粥樣硬化的高效治療****物。

提起研究中最難忘的事情，張立煒說由于他所在的研究所缺少一個(gè)探測設(shè)備，為此不得不驅(qū)車幾百公里前往蘇州大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其青島大學(xué)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中心助理教授薛升為了他和小鼠的安全，親自開車載他前往蘇州。一路上，小鼠的味道彌漫整個(gè)汽車，最終他們安全抵達(dá)蘇州。因此，我十分感激薛升教授對(duì)我無微不至的關(guān)懷和幫助。

另外，由于冠心病患者具有凌晨發(fā)病的特點(diǎn)。因此當(dāng)時(shí)收取患者外周血常常需要半夜前往醫(yī)院收集，并到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步處理。張立煒說，雖然自己在本科期間已經(jīng)獲得駕駛證，但一直不敢在真實(shí)路況開車。在收集樣本的那段時(shí)間，他也得以明顯提高駕駛技術(shù)和膽量。

張立煒今年 26 歲，出生于山東省青島市，目前博士就讀于德國慕尼黑大學(xué)，并在德國亥姆霍茲糖尿病研究中心從事心血管疾病與糖尿病的相關(guān)研究。該研究完成于在青島大學(xué)讀碩期間，在國內(nèi)時(shí)他還曾跟隨青島大學(xué)附屬醫(yī)院周長勇教授從事臨床冠心病的診治工作。
對(duì)于未來張立煒表示，目前人工智能正在醫(yī)學(xué)行業(yè)興起。AlphaFold 2 的發(fā)布大大加快了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析和抗體行業(yè)的發(fā)展。他認(rèn)為使用大規(guī)模訓(xùn)練集完美預(yù)測抗體結(jié)合抗原，將成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

相比新興 AI 計(jì)算，傳統(tǒng)生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)仍存在效率低效、資源消耗嚴(yán)重的問題。在這一問題上，他將和愛人將繼續(xù)結(jié)合人工智能技術(shù)開發(fā)出更高效的疾病相關(guān)抗體。
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