可編輯堿基對(duì)長(zhǎng)度從幾十?dāng)U至數(shù)千，「先導(dǎo)編輯」系統(tǒng)讓治療復(fù)雜遺傳病成為可能？業(yè)內(nèi)人士：遞送挑戰(zhàn)仍存，長(zhǎng)期安全性有待觀察

在剛剛結(jié)束的 2021 年，基因編輯領(lǐng)域交出了令人較為欣喜的成績(jī)單。

6 月，諾獎(jiǎng)得主 Jennifer Doudna 創(chuàng)辦的公司 Intellia 和再生元共同發(fā)布一項(xiàng) CRISPR 候選****物臨床 I 期試驗(yàn)中期數(shù)據(jù)，結(jié)果表明該****物實(shí)現(xiàn)了對(duì)患者肝臟內(nèi)細(xì)胞的基因編輯，且安全性良好。這一試驗(yàn)結(jié)果以題為“CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis”的文章發(fā)表在國(guó)際頂尖醫(yī)學(xué)期刊 The New England Journal of Medicine (NEJM) 上，為全球范圍內(nèi)首個(gè)公開(kāi)報(bào)告的體內(nèi) CRISPR 基因編輯療法臨床試驗(yàn)結(jié)果，并被 Science 納入當(dāng)年 “年度十大科學(xué)突破”。

12 月，基因編輯領(lǐng)域知名科學(xué)家劉如謙（David R. Liu）團(tuán)隊(duì)在 Nature Biotechnology 上發(fā)表論文表示，其對(duì)基因編輯系統(tǒng) “先導(dǎo)編輯”（Prime Editor，以下簡(jiǎn)稱(chēng) PE）進(jìn)行了更新，新版本的 PE（PE3.0）在人類(lèi)細(xì)胞中可編輯的基因長(zhǎng)度擴(kuò)展至數(shù)千對(duì)堿基（長(zhǎng)度相當(dāng)于一條完整的基因），而上一版本系統(tǒng)中這一數(shù)字為數(shù)十。這一突破被認(rèn)為是基因編輯治療向更安全、更精準(zhǔn)邁出的重要一步。

“實(shí)現(xiàn)大片段堿基對(duì)的修復(fù)，有助于擴(kuò)寬基因編輯技術(shù)治療疾病的范圍?！?nbsp;瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院副教授鄭宗立對(duì)生輝如此表示。

其實(shí)，回顧 20 世紀(jì)末至今，基因編輯領(lǐng)域共出現(xiàn)三大主流技術(shù)，從 ZFN、TALENs，再到如今被廣泛使用的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高，應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，為基因功能研究提供有力工具的同時(shí)，也讓傳統(tǒng)手段無(wú)法醫(yī)治的復(fù)雜疾病看到可被治療的希望。

從工作機(jī)制上看，ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 都是在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)引起 DNA 雙鏈斷裂，進(jìn)而激活細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制，完成基因的編輯。只是，與 ZFN 和 TALEN 技術(shù)需靶向 DNA 序列中特異性蛋白誘發(fā) DNA 雙鏈的斷裂不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)則避免了這一繁瑣的步驟，通過(guò)利用一段特定序列的向?qū)?nbsp;RNA 分子（guide RNA，gRNA）將核酸內(nèi)切酶引至靶點(diǎn)，更高效地完成基因編輯，這也是 CRISPR/Cas 技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的原因。

這三種基因編輯方法下，可有效改變基因的表達(dá)，但缺少對(duì)基因編輯結(jié)果的掌控：DNA 雙鏈斷裂后的自我修復(fù)過(guò)程中，較易引起隨機(jī)插入、缺失的異源末端連接以及需要同源模板才可激活同源重組修復(fù)的情況，存在一定的不確定性。

面對(duì)這一問(wèn)題，科學(xué)家在不斷探索新的方案。2016 年，David Liu 團(tuán)隊(duì)在 Nature 發(fā)表論文表示，他們開(kāi)發(fā)了 CRISPR-Cas9 單堿基編輯器，可在不導(dǎo)致 DNA 雙鏈斷裂的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組點(diǎn)突變的定向修改；2019 年，David Liu 團(tuán)隊(duì)公布其基于 CRISPR-Cas9 開(kāi)發(fā)的無(wú)需 DNA 雙鏈斷裂的基因編輯系統(tǒng) ——Prime Editor（“先導(dǎo)編輯” 系統(tǒng)），相關(guān)論文發(fā)表在 Nature 上。

可以說(shuō)，CRISPR/Cas 打開(kāi)了高效基因編輯的新局面，而在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的 Prime Editor 實(shí)現(xiàn)了更精準(zhǔn)的基因編輯。

如上述提到的 David Liu 團(tuán)隊(duì) 2019 年所發(fā)文章標(biāo)題所示，Prime Editor 是一款遵循 “查找 - 替換”（search-and-replace）邏輯運(yùn)行的基因編輯系統(tǒng)。

為實(shí)現(xiàn)如文字編輯器中方便快捷的 “查找 - 替換” 工具效果，他們率先對(duì) CRISPR-Cas9 系統(tǒng)兩大組成部分 ——Cas9 酶和 gRNA 進(jìn)行了 “替換”：一方面將向?qū)?RNA 分子進(jìn)行改造，在其 3' 端添加一段 RNA 序列，即引物結(jié)合序列（Primer binding site，PBS）和轉(zhuǎn)錄模版序列（RT template），形成能夠結(jié)合特定目標(biāo)基因且自帶基因編輯模板的 RNA 分子，被稱(chēng)作基于改造的向?qū)?RNA（the engineered guide RNA ，the pegRNA）；另一方面，用 Cas9 切口酶（Cas9 nickase）和逆轉(zhuǎn)錄酶融合而成的蛋白復(fù)合體替換 Cas9 酶

該 PE 系統(tǒng)之下，Cas9 切口酶可在 pegRNA 指引下定位到目標(biāo)位置，對(duì) DNA 單鏈進(jìn)行切割。之后 pegRNA 3′端的引物結(jié)合序列與切斷前的互補(bǔ)序列識(shí)別配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄酶以 pegRNA 上與引物結(jié)合序列形成后的序列為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將目標(biāo)序列聚合至切斷的 DNA 鏈上。接下來(lái)，細(xì)胞將通過(guò)自身的 DNA 修復(fù)機(jī)制把新的 DNA 序列整合到基因組。

這樣，在 pegRNA 的 “限制” 下，該系統(tǒng)可有效減少脫靶效應(yīng)，在切斷 DNA 單鏈的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)堿基的精準(zhǔn)轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，最多可插入 44bp，或刪除 80bp，若超過(guò) 100bp 的 DNA 片段，系統(tǒng)編輯效率將會(huì)降低。這一研究論文中提到，理論上，PE 系統(tǒng)可對(duì)人類(lèi) 89% 遺傳疾病相關(guān)的基因變異進(jìn)行糾正。

但應(yīng)用于實(shí)際研究或治療人類(lèi)遺傳疾病，需要編輯的 DNA 片段要更長(zhǎng)。為擴(kuò)大基因編輯技術(shù)研究和治療疾病的范圍，在那之后，David Liu 團(tuán)隊(duì)對(duì) PE 系統(tǒng)進(jìn)行了兩次升級(jí)。

他們發(fā)現(xiàn)，PE 系統(tǒng)中使用的 pegRNA3' 端降解導(dǎo)致系統(tǒng)活性降低，為基因編輯效率較低的一大原因。對(duì)此，David Liu 團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了工程化的 pegRNA，將 PE 系統(tǒng)基因編輯效率提升 3-4 倍。這一研究進(jìn)展于 2021 年 10 月發(fā)表在 Nature Biotechnology 上。

12 月，David Liu 團(tuán)隊(duì) PE 系統(tǒng)的升級(jí)版 “twinPE” 在 Nature Biotechnology 上發(fā)布，使用 twinPE 系統(tǒng)，可插入、替換或刪除的序列長(zhǎng)度約為 800bp。在 twinPE 系統(tǒng)中，David Liu 團(tuán)隊(duì)將 pegRNA 增加至兩條，進(jìn)行基因編輯過(guò)程中，這兩條 pegRNA 將在特定位置分別對(duì) DNA 鏈進(jìn)行切割。同樣是 DNA 雙鏈斷裂，不同的是，twinPE 選擇在不同位置對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行切割，確保 DNA 雙鏈不完全斷裂，實(shí)現(xiàn)基因編輯結(jié)果的可控性。

此次研究中，他們?cè)谌梭w細(xì)胞中對(duì)引起罕見(jiàn)遺傳病亨特綜合征（Hunter syndrome）的相關(guān)基因進(jìn)行了編輯，該疾病由長(zhǎng)度為 4000bp 的 DNA 片段導(dǎo)位引起。研究人員使用 twinPE 將數(shù)千堿基對(duì)大小的 DNA 片段精確插入到基因組的異常位點(diǎn)。

這表明，twinPE 系統(tǒng)具備應(yīng)用于大型基因突變所致遺傳疾病治療的潛力。

然而，對(duì)于基因治療領(lǐng)域繞不開(kāi)的遞送問(wèn)題，PE 系統(tǒng)自然也不例外。而且，“ Priem Editor 帶有的逆轉(zhuǎn)錄酶比較大，更增加了遞送難度?！?/span>

除此之外，“基因治療面臨的挑戰(zhàn)還包括精確的編輯（PE仍可產(chǎn)生Indel副產(chǎn)物）、未知的人體系統(tǒng)免疫反應(yīng)以及脫靶等長(zhǎng)期安全性問(wèn)題”。鄭宗立說(shuō)道，該系統(tǒng)引入的逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)于人體屬于“外來(lái)物”，它是否會(huì)對(duì)細(xì)胞及人體產(chǎn)生潛在的影響，還需要長(zhǎng)期的觀察。
過(guò)去兩年，全球體內(nèi)基因編輯療法開(kāi)始進(jìn)入臨床，首例人體試驗(yàn)數(shù)據(jù)也在去年公布。而對(duì)于基因編輯技術(shù)更大規(guī)模地應(yīng)用于臨床，鄭宗立表示，長(zhǎng)期安全性、有效性問(wèn)題仍是最大的挑戰(zhàn)。
參考資料：

• https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
• https://www.science.org/content/article/breakthrough-2021#section_breakthrough
• https://www.nature.com/articles/s41587-021-01133-w
• https://www.broadinstitute.org/news/new-prime-editing-system-inserts-entire-genes-human-cells
• https://www.broadinstitute.org/news/new-crispr-genome-editing-system-offers-wide-range-versatility-human-cells
• https://mp.weixin.qq.com/s/9A6Vsxgz0IXaJ7e3L68Cmw
• https://baike.baidu.com/tashuo/browse/content?id=a800080106745dd97170f31f