人類大腦紡錘形神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄圖譜獲解析 激光顯微切割技術(shù)功不可沒

　　中科院昆明動物研究所日前宣布，該所宿兵研究組與中南民族大學中國人類腦庫中心開展合作，利用激光顯微切割和微量樣本RNA測序技術(shù)，解析了來源于人腦前扣帶回紡錘形神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄圖譜。該項目得到中科院先導專項和國家自然科學基金委重點項目的資助，相關(guān)成果已發(fā)表于國際知名神經(jīng)生物學刊物《Cerebral Cortex》上。

　　項目介紹

　　研究表明，舊大陸猴、猿類和人類等靈長類大腦進化出一類新的神經(jīng)細胞，稱為紡錘形神經(jīng)元(VEN)，人類大腦中的VEN數(shù)量是最多，但在新大陸猴等更原始的靈長類中則沒有這類神經(jīng)元存在。神經(jīng)生物學家猜測VEN可能參與人類社會認知能力等的高級認知功能，但由于VEN在大腦中分布的局限(僅集中分布于前腦島和前扣帶回兩個腦區(qū))以及技術(shù)上的局限性，人們對VEN的確切功能幾乎一無所知。因此，構(gòu)建該類細胞的轉(zhuǎn)錄圖譜是了解細胞功能的一個重要基礎(chǔ)性工作。

　　宿兵研究組利用激光顯微切割和微量樣本RNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了300多個VEN特異表達升高或降低的基因，并鑒定了4個新的VEN標記基因。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因與VEN的形態(tài)發(fā)育(如樹突分支和髓鞘化等)和功能(如人類社會情感類疾病等)都密切相關(guān)。人類VEN轉(zhuǎn)錄圖譜的解析，為了解這類在靈長類大腦進化和人類大腦起源中扮演重要角色的神經(jīng)元提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為研究人類神經(jīng)精神疾病(如自閉癥等)的發(fā)病機制提供了重要信息。

　　在這項研究中，激光顯微切割技術(shù)對分離細胞、提取RNA起到了重要作用。

　　激光顯微切割技術(shù)發(fā)展歷程

　　顯微切割技術(shù)是90年代初發(fā)展起來的一門新技術(shù)，它能夠從組織切片或細胞涂片上的任一區(qū)域內(nèi)切割下幾百個、幾十個同類細胞，甚至是單個細胞，再進行后續(xù)相關(guān)的分子生物學方面的研究如PCR、實時熒光定量PCR、蛋白質(zhì)組學和其他分析技術(shù)。顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷了手動直接顯微切割、機械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光顯微切割4個階段。

激光顯微切割平臺

　　1996年，美國國立衛(wèi)生院國家腫瘤研究所的首次開發(fā)出基于近紅外激光熔膜原理的激光捕獲顯微切割技術(shù)，用于動物細胞的切割和DNA、RNA分析。次年，美國Arcturus Engineering公司成功研制激光捕獲顯微切割系統(tǒng)，并實現(xiàn)商品化銷售。又過了5年之后，激光捕獲顯微切割才在植物研究中成功應用，此后這一技術(shù)在生物研究中迅速發(fā)展并被廣泛應用。激光顯微切割技術(shù)可將顯微鏡下觀察到的目標細胞直接用激光取出，與早期技術(shù)相比，這種技術(shù)有著快速、簡單、精確、特異性強、準確度高、細胞形態(tài)保持完好、細胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)保持完整等優(yōu)點。

　　激光顯微切割原理

　　目前激光顯微切割從激光類型和技術(shù)原理上可分為兩種，分別是基于近紅外激光(810nm波長)的LCM (激光捕獲顯微切割)和基于紫外激光(337～355nm波長)的LMD(激光顯微切割)兩種。前文所提的紡錘形神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄圖譜項目，采用的就是LCM技術(shù)。

　　LCM 系統(tǒng)包括倒置顯微鏡、固態(tài)紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物臺(固定載玻片)的操縱桿、電耦合相機及彩色顯示器。用于捕獲目標細胞的熱塑膜(乙烯乙酸乙烯酯，EVA)直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰與后繼實驗所用的標準 0.5ml離心管相匹配。

　　LCM技術(shù)的原理是在組織切片上方懸著機械臂控制的收集管，收集管的塑料帽表面有一層的熱塑膜(其最大吸收峰接近紅外激光波長)，在顯微鏡下選擇好目標細胞后，發(fā)射低能紅外激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜融化與目標細胞黏合再迅速凝固。接著目標細胞就粘附在塑料帽表面的EVA膜上并隨著塑料帽一起移走。

　　機械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脫水組織切片上的目標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，發(fā)射激光脈沖，瞬間升溫使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，并在幾毫秒內(nèi)與目標細胞黏合并迅速凝固。激光脈沖通常持續(xù)0.5～5.0毫秒，并且可在整個塑料帽表面進行多次重復，當組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘合力，就可以迅速分離大量的目標細胞。將塑料帽蓋在裝有緩沖液的離心管上，分離的細胞就轉(zhuǎn)移至離心管中，從而可以分析出目標細胞的分子生物學特征，用于進行后續(xù)研究。

　　EVA膜約100～200μm厚，能夠吸收激光產(chǎn)生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區(qū)域的溫度提高到90°C，保持數(shù)毫秒后又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。采用低能量紅外激光的同時也可避免損傷性光化學反應的發(fā)生。

　　LCM的優(yōu)點在于快速、簡單、精確、無污染，而且適用任何玻片類型，尤其是采用能量較低的近紅外光，不直接接觸樣品，激光發(fā)出的大部分能量都被熱塑膜吸收，對樣品影響較小。

　　而LMD技術(shù)則需要將標本切片裝片在薄膜載玻片或者薄膜覆蓋的玻璃載玻片上。脈沖紫外激光(UV-A)通過物鏡聚焦在切片上，沿著目標區(qū)域的邊緣移動切割，使選擇區(qū)域內(nèi)的細胞脫離下來且周圍組織完好。由于紫外激光的波長和生物組織的吸收峰非常接近，故常用于切割較厚的樣品組織。

　　激光顯微切割技術(shù)應用現(xiàn)狀

　　目前，激光顯微切割技術(shù)較以往的顯微切割技術(shù)有了突破性的進展，現(xiàn)已廣泛應用于神經(jīng)科學、癌癥研究、植物分析、法醫(yī)學或氣候研究等領(lǐng)域。該方法同時也適用于細胞培養(yǎng)的操作或蓋玻片的顯微雕刻。盡管應用日趨廣泛，但也有一些問題亟待解決，例如設(shè)備成本、進行組織切片時需要通過固定和染色才能進行細胞的形態(tài)學觀察，可能會影響細胞的狀態(tài)以及RNA、蛋白質(zhì)的變化等。

　　目前市場上主要有四家公司提供激光顯微切割的平臺，分別是美國賽默飛世爾、德國徠卡、德國蔡司和瑞士MMI，而推出世界上第一臺商用激光捕獲顯微切割系統(tǒng)的Arcturus則于2010年被賽默飛世爾收購。賽默飛世爾的旗艦產(chǎn)品ArcturusXT是唯一將基于紅外的LCM和基于紫外的LMD激光切割融為一體的顯微切割儀器，而蔡司、徠卡和MMI都只能使用紫外激光對目標細胞進行切割和收集。

　　ArcturusXT激光捕獲顯微切割系統(tǒng)有著開放的平臺，能夠升級并擴展應用以滿足不斷變化的研究需求。例如其開放的顯微鏡接口能讓用戶修改系統(tǒng)，可增加高分辨率的照相機以獲得更精確的影像。開放的系統(tǒng)設(shè)計還實現(xiàn)了載物臺插板的輕松互換，可容納不同的樣本形式，如神經(jīng)生物學研究所用的更大玻片。

　　徠卡提供LMD6500和LMD7000激光顯微切割系統(tǒng)，利用紫外激光分離顯微鏡頭之下的目標區(qū)域，并通過重力這種溫和的方法來收集樣品。在徠卡的兩款系統(tǒng)中，均使用高精度的光學組件來控制激光束移動。光束焦點有自動修正功能，可在全自動模式和交互模式中切換，同時顯微鏡樣品臺和樣品本身保持不動。通過這種專利方法，可以達到超乎想象的精度。

　　瑞士MMI公司主推CellEctor Plus單細胞分選系統(tǒng)和CellCut Plus激光顯微切割系統(tǒng)，利用固態(tài)紫外激光對組織切片等樣本中的目標細胞進行切割和收集。在整個分離過程中，激光都不與需要分離的樣本接觸，對樣本損傷小，從而保證了樣本RNA的完整性。此系統(tǒng)在樣本收集時采用PTP(Predefined Target Positioning)技術(shù)，將黏性管蓋劃分成若干區(qū)域，對組織切片中同種類型細胞進行黏附收集，提高樣品的收集效率，節(jié)省成本;通過計量統(tǒng)計可保證下游的核酸、蛋白實驗有足夠的樣本量。

　　蔡司的PALM MicroBeam也是利用聚焦激光束來切割和分離樣本，不過它收集樣本的方式比較特別。通過一種激光誘導的壓力波將細胞彈入管中。MicroBeam的彈射力就好像在您的樣品下方發(fā)生光誘導的微型爆炸，隨之而來的沖擊波向上推動組織。對于較大的區(qū)域，MicroBeam也可以使用粘性管蓋。